Ультрацентрифугирование градиента плотности для исследования эндоцитарной рециркуляции в клетках млекопитающих
Summary
Целью данной статьи является представление протокола подготовки рециркулирующих эндосом из клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы.
Abstract
Эндосомальный трафик является важным клеточным процессом, который регулирует широкий спектр биологических событий. Белки интернализуются из плазматической мембраны, а затем транспортируются в ранние эндосомы. Интернализованные белки могут быть переданы в лизосому для деградации или переработаны обратно в плазматическую мембрану. Надежный эндоцитарный путь рециркуляции необходим для балансировки удаления мембранных материалов от эндоцитоза. Сообщается, что различные белки регулируют этот путь, включая фактор АДФ-рибозилирования 6 (ARF6). Ультрацентрифугирование градиента плотности является классическим методом фракционирования клеток. После центрифугирования органеллы оседают на их изопикновой поверхности. Фракции собираются и используются для других последующих применений. Здесь описан протокол получения рециркулирующей эндосомной фракции из трансфектированных клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования градиента плотности. Выделенные фракции подвергали стандартному вестерн-блоттингу для анализа их белкового содержания. Используя этот метод, мы определили, что плазматическая мембрана, нацеленная на поглощение и подвижность клеток 1 (ELMO1), связанный с Ras субстрат ботулинического токсина C3 1 (Rac1) фактор обмена гуанина нуклеотида, осуществляется через ARF6-опосредованную эндоцитарную рециркуляцию.
Introduction
Эндосомальный трафик является важным физиологическим процессом, который включает в себя различные биологические события1,например, транспортировку сигнальных рецепторов, ионных каналов и молекул адгезии. Белки, локализованные на плазматической мембране, интернализуются эндоцитозом2. Интернализованные белки затем сортируются ранней эндосомой3. Некоторые из белков нацелены на лизосомы для деградации4. Тем не менее, значительное количество белков перерабатывается обратно на поверхность клетки путем быстрой переработки и медленных процессов переработки. При быстрой рециркуляции белки покидают ранние эндосомы и непосредственно возвращаются в плазматическую мембрану. И наоборот, при медленной рециркуляции белки сначала сортируются в эндоцитарный рециркуляционный отсек, а затем транспортируются обратно в плазматическую мембрану. Различные грузовые белки, например, клатрин, ретромерный комплекс, комплекс ретривера и белок синдрома Вискотта-Олдрича, а также комплекс SCAR Homologue (WASH), участвуют в таких процессах рециркуляции мембран4,5,6,7,8,9. Баланс эндоцитоза и события рециркуляции имеет решающее значение для выживания клеток и способствует различным клеточным событиям10,например, клеточной адгезии, миграции клеток, полярности клеток и трансдукции сигнала.
ARF6, небольшая ГТФаза, является зарегистрированным регулятором эндоцитарного оборота7,11,12. Различные исследовательские группы проиллюстрировали важность ARF6 в эндоцитарной рециркуляции13,14,15,16,17. Исследование направлено на изучение взаимосвязи между ARF6-опосредованным ростом нейритов и эндоцитарной рециркуляцией. В предыдущем отчете предполагается, что активация ARF6 происходит вверх по течению до активности Rac1 через действие на ELMO1-дедикатор комплекса цитокинеза 1 (DOCK180)18. Однако остается неясным, как ARF6 запускает опосредованную сигнализацию Rac1 ELMO1-DOCK180. Ультрацентрифугирование градиента плотности было использовано для исследования роли эндоцитарной рециркуляции, опосредованной ARF6, в таком процессе. Используя это, рециркулирующая эндосомсодержащая фракция была получена из клеточных лизатов19. Фракцию подвергали вестерн-блоттингу для анализа содержания белка. Результаты иммуноблота показали, что в присутствии FE65, обогащенного мозгом адапторного белка, активный ARF6 существенно повышал уровень ELMO1 в рециркулирующей эндосомной фракции. Следующий протокол включает процедуры для (1) трансфекции клеток млекопитающих; 2) подготовка образцов и колонок градиента плотности; и 3) получение рециркулирующей эндосомосодержащей фракции.
Protocol
Representative Results
Discussion
В приведенном выше протоколе описываются процедуры выделения эндосом рециркуляции из культивируемых клеток путем ультрацентрифугирования. Надежность этого метода была продемонстрирована последней публикацией22,доказывающей, что рециркулирующие эндосомы успешно выдел…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана средствами Совета по исследовательским грантам Гонконга, схемы прямых грантов CUHK, эндаумент-фонда United College и благотворительного фонда TUYF. Цифры в этой работе были адаптированы из нашей предыдущей публикации «ARF6-Rac1 сигнально-опосредованный рост нейритов потенцируется нейронным адаптером FE65 посредством оркестровки ARF6 и ELMO1», опубликованной в журнале FASEB в октябре 2020 года.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
References
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome – sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O’Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D’Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D’Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).
