Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von humanem Retinoblastom (RB) durch Einführung biallelischer RB1-Mutationen in humane embryonale Stammzellen (hESC). RB-Zelllinien konnten auch erfolgreich mit dem isolierten RB in einer Schale kultiviert werden.
Humane RB ist pädiatrischer Krebs, der tödlich ist, wenn keine Behandlung verabreicht wird. Da RB aus Zapfenvorläufern stammt, was in Nagetiermodellen relativ selten ist, ist ein vom Menschen und Nagetieren abgeleitetes Krankheitsmodell vorteilhafter, um die Mechanismen der menschlichen RB aufzudecken und die Ziele der Therapie zu suchen. Hierin beschreibt das Protokoll die Erzeugung von zwei geneditierten hESC-Linien mit einer biallelischen RB1-Punktmutation (RB1 Mut/Mut) bzw. einer RB1-Knockout-Mutation (RB1–/-). Während des Prozesses der Netzhautentwicklung wird die Bildung von RB beobachtet. Die RB-Zelllinien werden auch durch Trennung von den RB-Organoiden etabliert. Insgesamt haben wir durch die Differenzierung der geneditierten hESC-Linien in die retinalen Organoide unter Verwendung eines kombinierten 2D- und 3D-Differenzierungsprotokolls die menschliche RB in einer Schale erfolgreich rekonstruiert und ihren Ursprung als Zapfenvorläufer identifiziert. Es würde ein hilfreiches Krankheitsmodell für die Beobachtung der Genese, Proliferation und des Wachstums des Retinoblastoms sowie für die Weiterentwicklung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe liefern.
Das humane Retinoblastom (RB) ist ein seltener, tödlicher Tumor, der von den Netzhautzapfenvorläufern 1,2,3 abgeleitet ist und die häufigste Form der intraokularen Malignität im Kindesalterist 4. Die homozygote Inaktivierung des RB1-Gens ist die auslösende genetische Läsion in RB5. Mäuse mit RB1-Mutationen bilden jedoch nicht den Netzhauttumor2. Obwohl die Maustumoren durch die Kombination von Rb1-Mutationen und anderen genetischen Veränderungen erzeugt werden könnten, fehlen ihnen noch die Merkmale des menschlichen RB6. Dank der Entwicklung der retinalen Organoiddifferenzierung konnte das hESC-abgeleitete RB erhalten werden, das die Charaktere des menschlichen RB1 zeigt.
In den letzten zehn Jahren wurden zahlreiche Protokolle für die retinale Organoiddifferenzierung etabliert, darunter 2D7, 3D8 und eine Kombination aus 2D und 3D9. Die Methode, die hier verwendet wird, um die menschliche RB zu erzeugen, ist die Konsolidierung der adhärenten Kultur und der schwimmenden Kultur9. Durch die Differenzierung des RB1-mutierten hESC in retinale Organoide wird die Bildung von RB um den Tag 45 nachgewiesen, und dann vermehrt es sich schnell um Tag 60. Am Tag 90 ist die Isolierung von RBs und die Erzeugung der RB-Zelllinie möglich; Darüber hinaus umgibt RB fast alle retinalen Organoide am Tag 120.
Das von hESC abgeleitete RB ist ein innovatives Modell zur Erforschung des Ursprungs, der Tumorgenese und der Behandlung von RB. In diesem Protokoll werden die Erzeugung von Gen-Editing-hESC, die Differenzierung von RB und die Charakterisierung für RB detailliert beschrieben.
Das humane Retinoblastom (RB) wird durch die Inaktivierung von RB1 und die Dysfunktion des Rb-Proteins verursacht. In diesem Protokoll ist der RB1-KO hESC der entscheidende Schritt für die Erzeugung von RB in einer Schale. Während es auch bei RB1-/- hESC möglich ist, dass es aufgrund der Methoden der retinalen Organoiddifferenzierung10 zu keiner RB-Bildung kommt. In diesem Protokoll ist der Übergang von der adhärenten Kultur zur schwimmenden Kultur im Pro…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem 502-Team für die Hilfe. Diese Arbeit wird teilweise von der Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) und dem National Key R&D Program of China (2017YFA0105300) unterstützt.
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
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DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
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EDTA | Thermo | 15575020 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
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MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
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ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
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Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
Nucleofector 4D | Lonza | ||
RPMI | Sigma | R0883-500ML |