Reconstruir el retinoblastoma humano in vitro

Summary

Describimos un método para generar retinoblastoma humano (RB) mediante la introducción de mutaciones bialélicas RB1 en células madre embrionarias humanas (hESC). Las líneas celulares RB también podrían cultivarse con éxito utilizando el RB aislado en una placa.

Abstract

La RB humana es un cáncer pediátrico, que es letal si no se administra tratamiento. Como RB se origina a partir de precursores de conos, lo cual es relativamente raro en modelos de roedores, mientras que con respecto a las diferencias entre especies entre humanos y roedores, un modelo de enfermedad derivado de humanos es más beneficioso para descubrir los mecanismos de RB humano y buscar los objetivos de la terapia. En este documento, el protocolo describe la generación de dos líneas hESC editadas genéticamente con una mutación puntual RB1 bialélica (RB1 Mut/^Mut) y una mutación knockout RB1 (RB1–^/-), respectivamente. Durante el proceso de desarrollo de la retina, se observa la formación de RB. Las líneas celulares RB también se establecen segregando de los organoides RB. En conjunto, al diferenciar las líneas hESC editadas genéticamente en los organoides retinianos utilizando un protocolo de diferenciación combinada 2D y 3D, hemos reconstruido con éxito el RB humano en un plato e identificado su origen precursor de conos. Proporcionaría un modelo de enfermedad útil para observar la génesis, proliferación y crecimiento del retinoblastoma, así como para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.

Introduction

El retinoblastoma humano (RB) es un tumor raro y mortal derivado de los precursores del cono retiniano ^1,2,3, es el tipo más común de neoplasia maligna intraocular en la infancia⁴. La inactivación homocigótica del gen RB1 es la lesión genética iniciadora en RB⁵. Sin embargo, los ratones con mutaciones RB1 no logran formar el tumor retiniano². Aunque los tumores de ratón podrían generarse con la combinación de mutaciones Rb1 y otras modificaciones genéticas, todavía carecen de las características de RB⁶ humano. Gracias al desarrollo de la diferenciación de organoides retinianos, se pudo obtener el RB derivado de hESC, mostrando los caracteres del RB¹ humano.

En la última década se han establecido numerosos protocolos para la diferenciación de organoides retinianos, incluidos 2D⁷, 3D⁸ y una combinación de 2D y 3D⁹. El método utilizado aquí para generar el RB humano es la consolidación de la cultura adherente y la cultura flotante⁹. Al diferenciar el hESC mutado RB1 en organoides retinianos, la formación de RB se detecta alrededor del día 45, y luego prolifera rápidamente alrededor del día 60. En el día 90, es posible el aislamiento de RB y la generación de la línea celular RB; además, la RB rodea a casi todos los organoides retinianos en el día 120.

La RB derivada de hESC es un modelo innovador para explorar el origen, la tumorigénesis y los tratamientos para la RB. En este protocolo, se describe en detalle la generación de hESC de edición génica, la diferenciación de RB y la caracterización de RB.

Protocol

Este estudio está aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESC H9 se obtienen del Instituto de Investigación WiCell. 1. Generación de hESC mutado RB1 Vector de focalización CRISPR/Cas9 para el knockout (KO) de RB1. Diseña un par de sgRNA. Para la ablación de RB1, diríjase al primer exón de este gen. La secuencia de cebador hacia adelante es CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG,…

Representative Results

El procedimiento de generación de RB se dilucida en la Figura 1, que combina el cultivo adherente y flotante. Fue posible cosechar el RB humano de RB1-KO hESC y obtener la línea celular RB aislando los organoides RB. Aquí, el protocolo proporciona los detalles de la diferenciación en diferentes etapas (Figura 2). Las esferas huecas se forman en los primeros 3 días que se adhieren a la superficie de cultivo y luego se exp…

Discussion

El retinoblastoma humano (RB) es causado por la inactivación de RB1 y la disfunción de la proteína Rb. En este protocolo, el RB1-KO hESC es el paso fundamental para la generación de RB en un plato. Mientras que incluso con RB1–^/- hESC, es posible que no haya formación de RB debido a los métodos de diferenciación de organoides^{retinianos 10}. En este protocolo, la transferencia de la cultura adherente a la cultura flotante es esencial en el proceso de dife…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML