Rekonstruere humant retinoblastom in vitro

Summary

Vi beskriver en metode for å generere humant retinoblastom (RB) ved å introdusere bialleliske RB1-mutasjoner i humane embryonale stamceller (hESC). RB-cellelinjer kan også vellykket dyrkes ved hjelp av den isolerte RB i en tallerken.

Abstract

Human RB er pediatrisk kreft, som er dødelig hvis ingen behandling administreres. Siden RB stammer fra kjegleforløpere, som er relativt sjelden i gnagermodeller, er en sykdomsmodell avledet fra mennesker mer gunstig for å avdekke mekanismene til menneskelig RB og søke målene for terapi. Her beskriver protokollen genereringen av to genredigerte hESC-linjer med henholdsvis en biallelisk RB1-punktmutasjon (RB1 ^Mut/Mut) og en RB1-knockoutmutasjon (RB1–^/-). Under prosessen med retinal utvikling observeres dannelsen av RB. RB-cellelinjene etableres også ved å segregere fra RB-organoidene. Til sammen, ved å differensiere de genredigerte hESC-linjene i retinale organoider ved hjelp av en 2D- og 3D-kombinert differensieringsprotokoll, har vi vellykket rekonstruert den menneskelige RB i en tallerken og identifisert dens kjegleforløperopprinnelse. Det ville gi en nyttig sykdomsmodell for å observere retinoblastomgenes, spredning og vekst, samt videreutvikle nye terapeutiske midler.

Introduction

Humant retinoblastom (RB) er en sjelden, dødelig svulst avledet fra retinal kjegleforløperne ^1,2,3, er den vanligste typen intraokulær malignitet i barndommen⁴. Homozygot inaktivering av RB1-genet er den initierende genetiske lesjonen i RB⁵. Imidlertid klarer ikke mus med RB1-mutasjoner å danne retinaltumoren². Selv om musetumorene kan genereres med kombinasjonen av Rb1-mutasjoner og andre genetiske modifikasjoner, mangler de fortsatt egenskapene til menneskelig RB⁶. Takket være utviklingen av retinal organoiddifferensiering, kunne den hESC-avledede RB oppnås, og vise tegnene til menneskelig RB¹.

Tallrike protokoller for retinal organoiddifferensiering har blitt etablert i det siste tiåret, inkludert 2D⁷, 3D⁸ og en kombinasjon av 2D og 3D⁹. Metoden som brukes her for å generere den menneskelige RB er konsolideringen av tilhengerkultur og flytende kultur⁹. Ved å differensiere RB1 mutert hESC i retinale organoider, oppdages dannelsen av RB rundt dag 45, og deretter sprer den seg raskt på rundt dag 60. På dag 90 er isolering av RBer og generering av RB-cellelinjen mulig; Videre omgir RB nesten alle retinale organoider på dag 120.

hESC-avledet RB er en innovativ modell for å utforske opprinnelse, tumorigenese og behandlinger for RB. I denne protokollen er genereringen av genredigering hESC, differensiering av RB og karakterisering for RB beskrevet i detalj.

Protocol

Denne studien er godkjent av den institusjonelle etiske komiteen i Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs er hentet fra WiCell Research Institute. 1. Generering av RB1 mutert hESC CRISPR/Cas9 målvektor for knockout (KO) av RB1. Design et par sgRNA. For ablasjon av RB1, målrette den første ekson av dette genet. Den fremre primersekvensen er CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, og den omvendte primersekvensen er AAACCCGAAAAACGGCCGCC…

Representative Results

Prosedyren for RB-generering er belyst i figur 1, som kombinerer tilhenger og flytende kultur. Det var mulig å høste den menneskelige RB fra RB1-KO hESC, og oppnå RB-cellelinjen ved å isolere RB-organoider. Her gir protokollen detaljer om differensieringen i ulike stadier (figur 2). Hule kuler dannes i løpet av de første 3 dagene som festes til kulturoverflaten og deretter utvides (figur 2<…

Discussion

Humant retinoblastom (RB) er forårsaket av inaktivering av RB1 og dysfunksjon av Rb-protein. I denne protokollen er RB1-KO hESC det sentrale trinnet for generering av RB i en tallerken. Mens selv med RB1-/- hESC, er det mulig at det ikke er noen ^RB-dannelse på grunn av metodene for retinal organoiddifferensiering¹⁰. I denne protokollen er overføringen fra tilhengerkultur til flytende kultur viktig i differensieringsprosessen. Tettheten av cyster, typer plur…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML