يفصل هذا البروتوكول المبسط سير العمل للكشف عن البكتيريا في عينات الأنسجة المعقدة وصورها ، من إصلاح الأنسجة إلى تلطيخ الميكروبات بالفلورسنت في التهجين الموقعي .
قياس توطين الميكروبات داخل سياقها في الجسم الحي هو خطوة أساسية في الكشف عن العلاقات الوظيفية بين الميكروبات والأمعاء الفقارية. يتم التحكم في المناظر الطبيعية المكانية للميكروبات الأمعاء بإحكام من خلال الميزات المادية – المخاط المعوي ، سرداب ، وطيات – ويتأثر الخصائص التي يسيطر عليها المضيف مثل الحموضة ، وتوافر الأكسجين ، والعوامل المناعية. تحد هذه الخصائص من قدرة الميكروبات ومسببات الأمراض على حد سواء على استعمار الأمعاء بشكل ثابت. على نطاق ميكرون، تحدد المنظمة الميكروبية التفاعلات القريبة المدى بين الميكروبات المختلفة وكذلك التفاعلات بين الميكروبات ومضيفها. ثم تؤثر هذه التفاعلات على وظيفة الجهاز على نطاق واسع وصحة المضيف.
يمكن هذا البروتوكول من تصور التنظيم المكاني للكائنات الحية المجهرية للأمعاء من المسافات بين الخلايا إلى المقاييس على نطاق الجهاز. وتستند هذه الطريقة على إصلاح أنسجة الأمعاء مع الحفاظ على بنية الأمعاء وخصائص المخاط. ثم يتم تضمين العينات الثابتة ومقسمة وملطخة لتسليط الضوء على أنواع بكتيرية محددة من خلال الفلورسينس في التهجين الموقعي (FISH). يتم تسمية ميزات المضيف ، مثل المخاط ومكونات الخلية المضيفة ، بالليكتينات المسماة بالفلورسنت. وأخيرا، يتم تصوير المقاطع الملطخة باستخدام مجهر كونفوج باستخدام التصوير بمسح البلاط عند التكبير العالي لسد موازين طول الميكرون إلى سنتيمتر. يمكن تطبيق هذا النوع من التصوير على أقسام الأمعاء من النماذج الحيوانية والخزعات من الأنسجة البشرية لتحديد الجغرافيا الحيوية للميكروبات في الأمعاء في الصحة والمرض.
تقنيات التصور الميكروبي لها أصول قديمة قدم علم الأحياء المجهرية نفسه ، عندما استخدم أنتوني فان ليوينهوك مجهره لمراقبة البكتيريا (التي أطلق عليها اسم “الحيوانات”) من لوحة الأسنان والبراز في القرن السابع عشر . ومنذ ذلك الحين، تم تطوير العديد من التقنيات لتصور التنظيم المكاني لاتحاد البكتيريا والفطريات والفيروسات التي تعيش مرتبطة بمضيف الكائنات الحية الدقيقة1. توضيح توطين هذه الميكروبات أمر ضروري لتحديد وظيفتها داخل مضيفها الحيواني. الجغرافيا الحيوية للبكتيريا مهمة في التصنيفات المشتركة والإمراضية على حد سواء ، حيث أن القرب من مواقع محددة (على سبيل المثال ، الظهارة) ، والركائز الغذائية ، والميكروبات المحددة قد يملي الإنتاج البكتيري من الأيض الكامنة وراء الأنواع والتفاعلات بين المملكة.
هيكل رئيسي يفصل بين البكتيريا والأنسجة المضيفة في العديد من مواقع الجسم المتباينة ، مثل تجويف الفم أو الأمعاء أو الرئة ، هو المخاط – طبقة منتجة من المضيف تمنع نقل الميكروبات إلى الخلايا الظهارية المضيفة وتعمل كمورد غذائي للميكروبات2،3،4 . ويتسم توصيف الخروقات والتغيرات في هذا الحاجز بأهمية رئيسية، مما يؤدي إلى نظرة آلية إلى التفاعلات بين المضيف والميكروبيوتا التي لن يتم الحصول عليها عن طريق التسلسل وحده5،6،7. على سبيل المثال، مكن التصوير من اكتشاف أن التعرض للمضادات الحيوية يمكن أن يعطل طبقة المخاط ومنظمة الكائنات الحية الدقيقة7،8، وأن المسهلات قد تستنفد المخاط، وترتبط بتغيرات كبيرة في المعلمات المناعية5.
يحدد هذا البروتوكول إطارا عاما لإصلاح وتلطيخ وتصوير الكائنات الحية المجهرية والأنسجة المضيفة (الشكل 1) ، المبني على عمل يوهانسون وهانسون9. في حين أن هذا البروتوكول على غرار في سياق الأقسام المعوية، فإنه يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الأنسجة الأخرى. ويمكن هذا البروتوكول من تجهيز عينات سريرية تجريبية من الحيوانات أو الإنسان؛ وقد أدرجت ملاحظات لمعالجة كلا النوعين من العينات. في المثال المعروض هنا ، تم تسمية ظهارة المضيف والبكتيريا الإنارة في وقت واحد مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) تلطيخ, المخاط مع الفلورسين (FITC) – الليكتين المقترنة, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), وتصنيف بكتيري محدد باستخدام FISH. عادة ما يتم تصميم تحقيقات FISH مقابل جينات 16S rRNA الخاصة بالتصنيف لضمان الإشارة العالية من ربط نسخة عالية.
في هذا المثال، يستهدف المسبار 16S rRNA من عائلة موريباكولاسا البكتيرية (الشكل 2). ومع ذلك ، يتم استبدال البقع بسهولة بمسابير FISH مختلفة و / أو lectins لاستيعاب السؤال البيولوجي المناسب. يمكن العثور على تحقيقات FISH التي تم التحقق من صحتها سابقا على ProbeBase10 ، وهو مورد عبر الإنترنت لمسابير أوليغونوكليوتيد المستهدفة من rRNA ، أو على SILVA11 ، وهي قاعدة بيانات الحمض النووي الريبي الريبوسومي. لتصميم تحقيقات جديدة، يمكن للقارئ الرجوع إلى خطوط أنابيب جديدة مثل HiPR-FISH8 أو Oligominer12. باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن مراقبة التعبئة الدقيقة للبكتيريا في التجويف المعوي والميزات المختلفة للمخاط المعوي في جميع أنحاء الجهاز الهضمي. ويمكن سير العمل الموصوف هنا من التحليل الكمي للكائنات الحية المجهرية في السياق المكاني للبيئة المضيفة لها.
يوفر البروتوكول الموضح أعلاه طريقة قابلة للاستنساخ لتصور واجهة المضيف-الكائنات الحية الدقيقة. وقد استفادت هذه المقايسات إلى حد كبير من تطوير البروتوكول ، بدءا من تحسين وضع العلامات FISH18 إلى الحفاظ على المخاط والتصوير9. كما يوفر التثبيت والتضمين تخزينا مفيدا للعينات؛ وعلاوة على ذلك، يمكن إرسال أشرطة البارافين المتسللة بالبريد دون أي قيود، حيث أن العينات ثابتة تماما وغير خاملة.
الأهمية والطرق البديلة
مزيج من الأسماك وتلطيخ المخاط تمكن من تحليل تكوين الكائنات الحية الدقيقة في مواقع الأنسجة محددة والتفاعل بين البكتيريا الفردية والمضيف. التقنيات البديلة التي تنطوي على تحليل مواقع محددة داخل الكائنات الحية الدقيقة عادة ما تكون غير قادرة على استكشاف طبيعة الخلية الواحدة من هذه التفاعلات، كما هو الحال في الالتصاق الدقيق التقاط الليزر إلى جانب التسلسل19. ومع ذلك ، فإن التقنيات القائمة على التسلسل لديها ميزة القدرة على التقاط التركيبة الوراثية للميكروبات على مستوى أدق وعلى نطاق أوسع من مسابير rRNA 16S.
ومن عثرات البروتوكول المقدم أنه يوفر لقطة لمرة واحدة للكائنات الحية المجهرية فيما يتعلق بالمضيف. بالنسبة للتصوير في الوقت الحقيقي في الحيوانات الحية، يلزم استخدام تقنيات تصوير خاصة لتسهيل الحصول على إشارة مضان في الأنسجة العميقة (مثل المجهر ثنائي الفوتونات ومجهر مضان الورقة الخفيفة20,21). في هذه الطرق ، يتم استعمار الكائن الحي النموذجي إما بالبكتيريا الملطخة بالجزيئات التي ترتبط ب envelope20 أو البكتيريا المعدلة وراثيا التي تؤوي بروتينات فلورية21. في الحالة الأخيرة ، فإن نضوج البروتينات الفلورية هو قضية رئيسية لأن معظم البروتينات الفلورية القياسية تتطلب الأكسجين لتنبعث منها الضوء. لذلك ، هناك حاجة إلى كائنات نموذجية لديها بيئات غير نانايروبية على الأقل (تركيز الأكسجين النانوي) ، مثل gut21 حمار وحشي هوائي.
في هذا البروتوكول، يستخدم الميثانول-Carnoy كمثبت بدلا من البارافورمالديهايد أو الفورمالين لأنه لا يحتوي على الماء. وهذا يمنع الترطيب والجفاف وانهيار طبقة المخاط أثناء المعالجة ويسهل القياسات الدقيقة لسمك المخاط. في حين أصبح تثبيت الميثاكارن وتضمين البارافين معيارا في هذا المجال ، فقد تم التحقيق في مثبتات وتقنيات تضمين مختلفة لتحسين الحفاظ على المخاط9،22 ، مع بعض الدراسات التي تشير إلى أن الراتنجات قد تكون متفوقة على البارافين embedding22. وثمة قيد هام آخر على تضمين البارافين والتثبيت الميثاكارن هو فقدان فلورية البروتين الفلوري، التي يمكن تجنبها باستخدام مثبتات بديلة (مثل الفورمالين أو البارافورمالديهايد (PFA)) أو تقنيات التضمين المعدلة23. كل مثبت له فوائد وعيوب ، واختيار المثبت يعتمد على أولويات التصوير. ويمكن الجمع بين طرائق التصوير إذا تم إصلاح التكاثر البيولوجي في كل من PFA و methacarn وتم الحصول على الصور من كلتا العينتين.
وقد تم الجمع بين الأسماك مع immunofluorescence في حالات معزولة مع محددة مضادة لل Muc2C3 أرنب الأجسام المضادة متعددة النسيلة9،24. لم يتم استنساخ هذه النتائج على نطاق واسع مع الأجسام المضادة Muc2 الأخرى ، مما يشير إلى أن اختيار الأجسام المضادة قد يكون حاسما في نجاح تركيبة الفلورسينس المناعية FISH. شروط تلطيخ الأجسام المضادة الناجحة لأجسام مضادة معينة قد لا تسمح بالاحتفاظ بتلطيخ الأسماك.
استكشاف الاخطاء
في هذا البروتوكول، يمثل جمع العينات والأقسام والتلطيخ خطوات هامة لمنع إنشاء صور فنية. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الضغط على الأنسجة عند الجمع وقبل التضمين إلى سوء تقدير الكائنات الحية الدقيقة ويؤثر على جودة المخاط. وثمة اعتبار هام آخر هو تجنب الجمع بين شرائح من سمك مختلفة جدا في كاسيت واحد، مثل قطعة فارغة نسبيا من الأمعاء الدقيقة والكريه داخل القولون البعيدة. تؤدي السمكات المختلفة إلى صعوبات في التصوير: بعد التضمين، قد يكون المقطع العرضي على عمق محدد لشريحة واحدة في العمق الخاطئ للتصوير للجزء الآخر (على سبيل المثال، سيكون التجويف في أعماق مختلفة لكل نسيج) (الشكل 1B وC والشكل 3A). وعلاوة على ذلك، لتصوير الكريات البراز نموذج الحيوان، فإنها قد تكون ملفوفة في الغشاء البريتوني24. في هذه التقنية، يتم طي جزء صغير من الصفاق المعزول حديثا بلطف حول البراز ويحافظ على بنية الكريات أثناء خطوات الغسيل الموضحة في البروتوكول.
على عكس معالجة الأنسجة الحيوانية ذات المحتويات ، يمثل تصوير عينات الأمعاء البشرية بعض التحديات. على وجه التحديد، من المرجح أن تتعطل المحتويات الإنارة والبطانة المخاطية بسبب إعداد الأمعاء تنظير القولون الذي يتم إجراؤه عادة قبل خزعات الأمعاء أو إجراءات استئصال الأمعاء. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم جمع الخزعات ، من المفيد ملاحظة اتجاه الأنسجة للمساعدة في تحديد ميزات محددة (على سبيل المثال ، التجويف مقابل الغشاء المخاطي) في غياب محتويات معوية. قد يكون التضمين المسبق مع 3٪ أجار و / أو أغار: خليط الجيلاتين مفيدا في الحفاظ على قطبية الأنسجة25؛ ومع ذلك ، هناك مشاكل مع الجفاف وتقسم أجار ، كما ورد في الأدبيات ، وأوقات المعالجة قد تحتاج إلى تغيير.
الجانب الرئيسي لتحقيق تلطيخ السمك جيدة يأتي من ضبط تركيز فورماميد لتحقيقات الأسماك محددة. سوف Formamide السيطرة على التهجين stringency من تحقيقات FISH إلى أهدافهم. من المهم التأكد من أن أ) يتم اختيار تركيز فورماميد السليم لتلطيخ مجتمع معين، وب) أن تركيز فورماميد مناسب ممكن حتى لتركيبة المسبار التي يتم استخدامها-وهذا قد يؤثر على اختيار المسبار الأمثل عند استخدام تحقيقات متعددة. مواقع مثل mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) قد تساعد في حساب تركيزات فورماميد المناسبة لتحقيق معين. في غياب معلومات حول تركيزات فورماميد المناسبة، يمكن اختبار هذا البروتوكول مع 0٪ و 10٪ فورماميد.
يتطلب تقسيم العينات المضمنة قطع الكتلة إلى عمق كاف للحصول على شرائح مضيئة ، حيث سيؤدي القسمة الضحلة جدا إلى كتلة إلى عرض مقطعي للزغب / سرداب بدون محتويات مضيئة (الشكل 3A). قم بتلطيخ العينات بعد فترة وجيزة من تقسيمها للحصول على إشارة FISH المثلى، واستخدم DAPI الطازج (أو DAPI المخزن عند -20 درجة مئوية) لحل مشكلات الخلفية (الشكل 3C). قد يؤدي تلطيخ الأسماك للأقسام التي يزيد عمرها عن شهر إلى تلطيخ أكثر فقرا / عدم اتساق.
إذا لم يكن النسيج أو غطاء الأغطية مسطحا تماما فيما يتعلق بالشريحة ، فقد لا تكون العينة في التركيز على كل موضع داخل مسح البلاط (الشكل 3B) ، مما يؤدي إلى إهدار الجهد والbleaching المحتمل. يمكن حل هذا عن طريق إجراء مسح البلاط أصغر التي تم التحقق من جميع المواقف لتكون في التركيز. يمكن أن يؤدي القسمة بشفرات باهتة أيضا إلى انفصال المخاط والمحتويات الإنارة ، والتي تظهر كمنااطق مظلمة كبيرة أثناء التصوير. وأخيرا، يمكن أن يؤدي تبخر المحلول أو الفقاعات أثناء خطوة التهجين إلى تلطيخ غير متساو لمسابير FISH في الأنسجة.
معلمة حاسمة أخرى تؤثر على كفاءة ربط مسبار FISH هي المنافسة بين المسابير المختلفة. فحص مفيد للتحقق من أن المسبار FISH هو وضع العلامات البكتيريا لفحص كولوكالينج الإشارة من التحقيق الأسماك مع DAPI (الشكل 2C، D). في العينات التي تتطلب استخدام مسابير rRNA متعددة ، يصبح ضبط المعلمات مثل درجة حرارة التهجين وتركيز المسبار والفورماميد أمرا حاسما لضمان أن المسابير ملزمة للأنواع الصحيحة بكفاءة18.
ملاحظات حول التصوير
من الأفضل تصور البكتيريا الملطخة بالأسماك باستخدام المجهر الكونفوجكال وهدف التكبير 40x على الأقل. في حين يفضل التكبير 63x لتصوير البكتيريا على مستوى خلية واحدة، يمكن أيضا استخدام التكبير 40x عن طريق تعظيم التكبير الرقمي أو استخدام نظام فائق الدقة. كما أن الأنظمة المجهزة بقدرات فائقة الدقة قد توفر دقة خلوية فرعية للخلايا البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام أهداف التكبير أقل للحصول على شعور عام من توطين البكتيريا وسماكة المخاط.
كما يوصى بشدة بالحصول على صور 16 بت بدلا من الصور ذات ال 8 بت ، حيث سيساعد النطاق الديناميكي الأعلى في التقاط النطاق الواسع لإشارة DAPI من النوى الساطعة للغاية للظهارة والإشارة الضعيفة نسبيا للبكتيريا الإنارة. وبصرف النظر عن استخدام إعداد التصوير المذكور أعلاه ، فإن أحد اعتبارات التصوير الهامة هو اختيار الفلوروفوريس. للحصول على أفضل فصل بين الأنواع البكتيرية، تأكد من عدم تداخل الفلوروفوريس المستخدم في أطياف الإثارة والانبعاثات (ما لم يكن التصوير على نظام لديه القدرة على أداء التمثيل الخطي). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المسابير في تركيبة (على سبيل المثال، الجمع بين مسبار خاص بالأسرة وتحقيق خاص بالجنس) لتحديد أفراد المجتمع الإضافيين. إذا كان استخدام مسابير خطي أو غير قابلة للتأكد، فمن الضروري لاختبار دقة ومستوى تلطيخ الأسماك على الثقافات النقية8،14.
بمجرد جمع الصور، تتوفر أدوات متعددة للتحليل الكمي للواجهة بين المضيف والميكروبيوتا، مثل BacSpace26 و HiPR-FISH8 وأدوات التقسيم الأخرى27. BacSpace هو برنامج MATLAB يسمح بتقسيم الأنسجة والمكونات الإنارة وإزالة المواد النباتية من images26. كما يقدم البرنامج تحليلا لسماكة المخاط في 2D وكمية التوزيع المكاني على أساس مسافات بكسل في قنوات مختلفة26. وعلى العكس من ذلك، يسمح برنامج تحليل الصور HiPR-FISH بتقسيم الخلايا الملطخة بالأسماك8. وأخيرا، يمكن أيضا تكييف أدوات التقسيم البكتيرية الأخرى التي تم تحسينها للتجارب المختبرية27 لهذا التطبيق.
استنتاج
في التصوير الموقعي تمكن التحليل الكمي للضريبة الميكروبية الفردية في سياق أعضاء المجتمع الآخرين والبيئات الدقيقة المختلفة التي تم إنشاؤها بواسطة النظام الغذائي والمخاط والسراديب الظهارية المضيفة. ويملي التفاعل بين الكائنات الحية بيولوجيا النظم الميكروبية المرتبطة بالمضيف ويوفر تحليلا أساسيا للتغيير في هذه الهياكل أثناء الاضطرابات التي لها آثار على الصحة. وتجدر الإشارة إلى أن القدرة على تصوير الكائنات الحية المجهرية في الموقع من خلال البروتوكول المذكور أعلاه توفر نافذة لا تصدق على الجغرافيا الحيوية للكائنات الحية المجهرية فيما يتعلق بمضيف الحيوان.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة كريستين إيرل على تطوير التقنية التي لا تقدر بثمن، وآمبر هان على المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والدكتورة جين نغوين وديانا بيبين على المراجعة النقدية للمخطوطة، والدكتور هشام سليمان ومختبر روسي في جامعة كولومبيا البريطانية لتوفير الوصول إلى المجهر. ويعترف المؤلفون بالدعم المقدم من فريق CIHR Grant: المبادرة الكندية للميكروبيوم 2 (C.T.) وكرون والتهاب القولون كندا (إلى C.T. وK.M.N.) ، CIFAR (إلى C.T. و K.M.N.) ، جائزة مايكل سميث للباحثين في مجال البحوث الصحية (إلى C.T.) ، ومؤسسة ويستون: مبادرة الميكروبيوم العائلية ويستون (إلى C.T.) ، جائزة بول ألن المحقق المتميز (إلى C.T.).
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |