这种简化的实验方案详细介绍了检测和成像复杂组织样品中细菌的工作流程,从固定组织到用荧光 原位 杂交染色微生物。
测量微生物在其 体内 环境中的定位是揭示微生物群与脊椎动物肠道之间功能关系的重要一步。肠道微生物群的空间景观受到物理特征(肠粘液、隐窝和褶皱)的严格控制,并受到宿主控制的特性(如pH值、氧气可用性和免疫因子)的影响。这些特性限制了共生微生物和病原体稳定定植肠道的能力。在微米尺度上,微生物组织决定了不同微生物之间的近距离相互作用以及微生物与其宿主之间的相互作用。然后,这些相互作用会影响大规模的器官功能和宿主健康。
该协议能够可视化从细胞之间的距离到器官范围的肠道微生物群空间组织。该方法基于固定肠道组织,同时保持肠道结构和粘液特性。然后将固定样品包埋,切片和染色,以通过荧光 原位 杂交(FISH)突出特定的细菌物种。宿主特征,如粘液和宿主细胞成分,用荧光标记的凝集素标记。最后,使用共聚焦显微镜对染色切片进行成像,利用高放大倍率的瓷砖扫描成像,将微米级与厘米长的尺度连接起来。这种类型的成像可以应用于动物模型的肠道切片和人体组织的活检,以确定健康和疾病中肠道微生物群的生物地理学。
微生物可视化技术的起源与微生物学本身一样古老,当时安东尼·范·列文虎克(Antonie Van Leeuwenhoek)在17世纪 使用他的显微镜观察牙菌斑和粪便中的细菌(他称之为”动物”)。从那时起,已经开发了许多技术来可视化与宿主相关的细菌,真菌和病毒联盟的空间组织 – 微生物群1。阐明这些微生物的定位对于确定它们在动物宿主体内的功能至关重要。细菌的生物地理学在共生和致病类群中都很重要,因为靠近特定位置(例如,上皮)、营养底物和特定微生物可能决定细菌产生潜在的种间和王国间相互作用的代谢物。
将细菌和宿主组织分离在几个不同的身体部位(如口腔,肠道或肺)中的关键结构是粘液 – 宿主产生的层,既可以防止微生物转移到宿主上皮细胞上,又可以作为微生物群的营养资源2,3,4.表征该屏障的破坏和变化至关重要,可以对宿主 – 微生物群相互作用进行机械学洞察,而仅通过测序无法获得5,6,7。例如,影像学检查发现抗生素暴露可以破坏粘液层和微生物群组织7,8,泻药可能会耗尽粘液,这与免疫参数的大幅变化相关5。
该协议概述了基于Johansson和Hansson9的工作构建的固定,染色和成像微生物群和宿主组织的一般框架(图1)。虽然该协议是在肠道切片的背景下建模的,但它可以很容易地适应其他组织类型。该协议能够处理实验动物或人类临床样本;包括处理这两种样品的注释。在此给出的示例中,宿主上皮和腔内细菌已同时用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚染色(DAPI)标记,粘液与荧光素(FITC)结合凝集素,Ulex europaeus凝集素I(UEA-1)和使用FISH的特定细菌分类群标记。FISH探针通常针对分类群的16S rRNA基因进行设计,以确保通过结合高拷贝转录本获得高信号。
在本例中,探针靶向Muribaculaceae细菌家族的16S rRNA(图2)。然而,染色剂很容易被不同的FISH探针和/或凝集素取代,以适应适当的生物学问题。先前验证的FISH探针可以在ProbeBase10上找到,ProbeBase10是rRNA靶向寡核苷酸探针的在线资源,也可以在RIVA11上找到,SILVA11是核糖体RNA数据库。对于新探针的设计,读者可以参考新的管道,如HiPR-FISH8或Oligominer12。使用该协议,可以观察肠道内细菌的紧密包装以及整个消化道中肠粘液的不同特征。这里描述的工作流程可以在其宿主环境的空间环境中对微生物群进行定量分析。
上述方案提供了一种可重复的方法来可视化宿主 – 微生物群界面。这些检测方法从方案开发中受益匪浅,从 FISH 标记优化18 到粘液保存和成像9。固定和包埋也提供了有用的样品储存;此外,石蜡浸润的盒可以不受任何限制地邮寄,因为样品是完全固定和惰性的。
意义和替代方法
FISH和粘液染色的结合可以分析特定组织位置的微生物群组成以及单个细菌与宿主之间的相互作用。涉及微生物群内特定位点分析的替代技术通常无法探索这些相互作用的单细胞性质,例如在激光捕获显微切割结合测序的情况下19。然而,基于测序的技术具有能够在比16S rRNA探针更精细和更广泛的水平上捕获微生物群的遗传组成的优势。
所提出的方案的一个缺陷是,它提供了与宿主相关的微生物群的一次性快照。对于活体动物的实时成像,需要特殊的成像技术来促进深层组织中荧光信号的采集(例如,活体内双光子显微镜和光片荧光显微镜20,21)。在这些方法中,模型生物要么被细菌定植,这些细菌被染色的分子与其包膜结合20 ,要么被含有荧光蛋白的转基因细菌21。在后一种情况下,荧光蛋白的成熟是一个关键问题,因为大多数标准荧光蛋白需要氧气来发光。因此,需要具有至少厌氧环境(纳摩尔氧气浓度)的模型生物,例如需氧斑马鱼肠道21。
在该协议中,甲醇 – Carnoy被用作固定剂而不是多聚甲醛或福尔马林,因为它不含水。这可以防止在加工过程中粘液层的水合作用,脱水和塌陷,并有助于准确测量粘液厚度。虽然甲基苯丙胺固定和石蜡包埋已成为该领域的标准,但已经研究了不同的固定剂和包埋技术以优化粘液保存9,22,一些研究表明树脂可能优于石蜡包埋22。石蜡包埋和甲基苯丙烷固定的另一个重要限制是荧光蛋白荧光的损失,这可以通过使用替代固定剂(例如福尔马林或多聚甲醛(PFA))或改良包埋技术来避免23。每种固定剂都有优点和缺点,固定剂的选择取决于成像优先级。如果生物重复固定在PFA和甲基卡恩中,并且从两个样品中获得图像,则可以组合成像方式。
FISH已与免疫荧光结合,在具有特异性抗Muc2C3兔多克隆抗体的分离实例中9,24。这些结果尚未与其他Muc2抗体广泛重现,表明抗体的选择可能对FISH-免疫荧光组合的成功至关重要。对给定抗体成功进行抗体染色的条件可能不允许保留 FISH 染色。
故障 排除
在该协议中,样品收集,切片和染色是防止产生成像伪影的关键步骤。例如,在收集时和包埋之前按压组织可能导致微生物群的位置错位并影响粘液质量。另一个重要的考虑因素是避免将厚度非常不同的片段组合在单个暗盒中,例如小肠的相对空的片段和远端结肠内的沉淀。不同的厚度导致成像困难:嵌入后,一个片段的特定深度的横向切片可能处于另一个片段成像的错误深度(例如,每个组织的管腔将处于不同的深度)(图1B,C 和 图3A)。此外,对于动物模型粪便颗粒的成像,它们可以包裹在腹膜24中。在这种技术中,在方案中概述的洗涤步骤中,将一小段新鲜分离的腹膜轻轻地折叠在粪便周围,并保持沉淀的结构。
与处理含有物的动物组织不同,对人体肠道样本进行成像存在一些挑战。具体而言,腔内内容物和粘膜内壁可能会被通常在肠道活检或切除手术前进行的结肠镜检查肠道准备破坏。此外,当收集活检时,在没有肠道内容物的情况下,记录组织方向有助于识别特定特征(例如,腔与粘膜下)。用3%琼脂和/或琼脂预包埋:明胶混合物可能有助于维持组织极性25;然而,正如文献中报道的那样,琼脂的脱水和切片存在问题,并且可能需要改变处理时间。
实现良好 FISH 染色的一个关键方面是调整特定 FISH 探针的甲酰胺浓度。甲酰胺将控制FISH探针与其靶标的杂交严格性。重要的是要确保a)选择适当的甲酰胺浓度来染色给定的群落,以及b)对于正在使用的探针组合甚至可以选择合适的甲酰胺浓度 – 这可能会影响使用多个探针时的最佳探针选择。诸如mathFISH(http://mathfish.cee.wisc.edu/)之类的网站可能有助于计算给定探针的适当甲酰胺浓度。在没有关于适当甲酰胺浓度的信息的情况下,可以使用0%和10%甲酰胺测试该协议。
切开嵌入的样品需要将块切割到足够的深度以获得腔内切片,因为将切片太浅到块中将导致没有腔内内容物的绒毛/隐窝的横截面视图(图3A)。切片后不久对样品进行染色以获得最佳FISH信号,并使用新鲜的DAPI(或储存在-20°C的DAPI)来解决背景问题(图3C)。对超过一个月大的切片进行 FISH 染色可能会导致染色较差/不一致。
如果组织或盖玻片相对于载玻片不是完全平坦的,则样品可能无法在瓷砖扫描中的每个位置聚焦(图3B),从而导致浪费精力和潜在的光漂白。这可以通过进行较小的磁贴扫描来解决,其中所有位置都已验证为焦点。用钝的刀片切片也可能导致粘液和腔内内容物脱落,在成像时表现为大的黑暗区域。最后,杂交步骤中溶液或气泡的蒸发可导致组织中FISH探针的染色不均匀。
影响FISH探针结合效率的另一个关键参数是不同探针之间的竞争。验证FISH探针是否标记细菌的有用检查是用DAPI检查来自FISH探针的信号的共定位(图2C,D)。在需要使用多个rRNA探针的样品中,调整杂交温度、探针浓度和甲酰胺等参数对于确保探针有效地与正确的物质结合至关重要18。
有关成像的注意事项
FISH染色的细菌最好使用共聚焦显微镜和至少40倍放大倍率的物镜进行可视化。虽然63倍放大倍率比在单细胞水平上成像细菌更可取,但40倍放大倍率也可以通过最大化数字变焦或采用超分辨率系统来使用。配备超分辨率功能的系统还可以提供单个细菌细胞的亚细胞分辨率。可以使用较低放大倍率的物镜来获得细菌定位和粘液厚度的一般感觉。
还强烈建议采集16位图像而不是8位图像,因为更高的动态范围将有助于从上皮的极亮核和腔内细菌的相对微弱的信号中捕获DAPI信号的宽范围。除了使用上述成像设置外,一个重要的成像考虑因素是荧光团的选择。为了在细菌类型之间实现最佳分离,请确保所使用的荧光团在激发和发射光谱中不重叠(除非在具有线性解氧能力的系统上进行成像)。此外,探针可以组合使用(例如,家族特异性探针和属特异性探针的组合)来识别其他群落成员。如果使用线性分离或未经验证的探针,则必须测试纯培养物上FISH染色的准确性和水平8,14。
一旦收集了图像,就可以使用多种工具对宿主 – 微生物群界面进行定量分析,例如BacSpace26,HiPR-FISH8和其他分割工具27。BacSpace是一款MATLAB软件,可以分割组织和腔内成分,并从图像中去除植物材料26。该程序还提供2D粘液厚度分析,并根据不同通道中的像素距离量化空间分布26。相反,HiPR-FISH图像分析软件允许对FISH染色的细胞进行分割8。最后,针对体外实验27优化的其他细菌分割工具也可以适应此应用。
结论
原位 成像能够在其他群落成员的背景下对单个微生物群落以及由饮食,粘液和宿主上皮隐窝产生的各种微环境进行定量分析。生物体之间的相互作用决定了宿主相关微生物系统的生物学,并为扰动期间这些结构的变化提供了对健康有影响的基本分析。值得注意的是,通过上述方案 在原位 成像微生物群的能力为微生物群与动物宿主相关的生物地理学提供了一个令人难以置信的窗口。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Kristen Earle博士的宝贵技术开发,Amber Hann博士的故障排除帮助,Jen Nguyen博士和Deanna Pepin博士对手稿的批评性审查,以及Hesham Soliman博士和不列颠哥伦比亚大学的Rossi实验室提供显微镜访问。作者感谢CIHR团队资助的支持:加拿大微生物组倡议2(C.T.),克罗恩病和结肠炎加拿大(C.T.和K.M.N.),CIFAR(C.T.和K.M.N.),迈克尔史密斯健康研究基金会学者奖(C.T.),韦斯顿基金会:韦斯顿家族微生物组倡议(C.T.),保罗艾伦杰出研究员奖(C.T.)。
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |