Denne strømlinede protokol beskriver en arbejdsgang til at opdage og billede bakterier i komplekse vævsprøver, fra fastsættelse af væv til farvning mikrober med fluorescerende in situ hybridisering.
Måling af lokalisering af mikrober inden for deres in vivo sammenhæng er et vigtigt skridt i at afsløre de funktionelle relationer mellem mikrobiota og hvirveldyr tarm. Det rumlige landskab i tarmens mikrobiota styres tæt af fysiske træk – tarm slim, krypter og folder – og påvirkes af værtskontrollerede egenskaber som pH, ilttilgængelighed og immunfaktorer. Disse egenskaber begrænser evnen af commensale mikrober og patogener ens at kolonisere tarmen stabilt. På mikron-skalaen bestemmer den mikrobielle organisation tæt-range interaktioner mellem forskellige mikrober samt samspillet mellem mikrober og deres vært. Disse interaktioner påvirker derefter storstilet organfunktion og værtssundhed.
Denne protokol gør det muligt visualisering af tarmen mikrobiota rumlige organisation fra afstande mellem celler til organ-dækkende skalaer. Metoden er baseret på fastsættelse af tarmvæv og samtidig bevare tarmstruktur og slim egenskaber. De faste prøver er derefter indlejret, sektionsopdelt og farves for at fremhæve specifikke bakteriearter gennem fluorescens in situ hybridisering (FISH). Værtsfunktioner, såsom slim og værtscellekomponenter, er mærket med fluorescerende mærket lectins. Endelig er de farvede sektioner afbildet ved hjælp af en konfokal mikroskop udnytte flise-scanning billeddannelse ved høj forstørrelse at bygge bro mikron til centimeter længde skalaer. Denne type billeddannelse kan anvendes på tarmafsnit fra dyremodeller og biopsier fra humane væv for at bestemme mikrobiotaens biogeografi i tarmen i sundhed og sygdom.
Mikrobielle visualiseringsteknikker har oprindelse, der er lige så gammel som mikrobiologien selv, da Antonie Van Leeuwenhoek brugte sit mikroskop til at observere bakterier (som han kaldte “animalcules”) fra tandplade og afføring i det 17. århundrede . Siden da er der udviklet mange teknikker til at visualisere den rumlige organisering af konsortiet af bakterier, svampe og vira, der lever forbundet med en host-the microbiota1. Belyse lokalisering af disse mikrober er afgørende for at bestemme deres funktion i deres dyrevært. Bakteriernes biogeografi er vigtig i både commensal og patogen taxa, da nærhed til bestemte steder (f.eks. epitelet), ernæringsmæssige substrater og specifikke mikrober kan diktere bakterieproduktion af metabolitter, der ligger til grund for interspecies og interaktioner mellem riget.
En nøglestruktur, der adskiller bakterier og værtsvæv i flere forskellige kropssteder, såsom mundhulen, tarmen eller lungen, er slimet – et værtsproduceret lag, der både forhindrer mikrobiel translokation på værtselelelestrengerne og tjener som en ernæringsmæssig ressource for mikrobiota2,3,4 . Karakterisering brud og ændringer i denne barriere er af afgørende betydning, hvilket fører til mekanistisk indsigt i host-mikrobiota interaktioner, der ikke ville blive opnået ved sekventering alene5,6,7. For eksempel, billeddannelse aktiveret opdagelsen af, at antibiotika eksponering kan forstyrre slim lag og mikrobiota organisation7,8, og at afføringsmidler kan nedbryde slim, korrelerer med store ændringer i immunparametre5.
Denne protokol skitserer en generel ramme for fastsættelse, farvning og billeddannelse af mikrobiota og værtsvæv (figur 1), bygget på Johanssons og Hansson9’s arbejde. Mens denne protokol er modelleret i forbindelse med tarm sektioner, det kan nemt tilpasses til andre vævstyper. Denne protokol muliggør behandling af enten eksperimentelle dyreprøver eller humane kliniske prøver. noter til behandling af begge typer prøver er medtaget. I eksemplet her, værten epitel og luminal bakterier er samtidig blevet mærket med 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) farvning, slim med fluorescein (FITC)-konjugeret lectin, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), og en specifik bakteriel takon ved hjælp af FISK. FISH sonder er normalt designet mod en taxon’s 16S rRNA gener for at sikre det høje signal fra bindende en høj kopi udskrift.
I dette eksempel er sonden rettet mod 16S rRNA af Muribaculaceae bakteriefamilien (figur 2). Pletterne erstattes dog let med forskellige FISH-sonder og/eller lectiner for at imødekomme det relevante biologiske spørgsmål. Tidligere validerede FISH sonder kan findes på ProbeBase10, en online ressource for rRNA-målrettede oligonukleotid sonder, eller på SILVA11, en ribosomal RNA database. Til design af nye sonder kan læseren henvise til nye rørledninger som HiPR-FISH8 eller Oligominer12. Ved hjælp af denne protokol er det muligt at observere den tætte pakning af bakterier i tarm lumen og de forskellige funktioner i tarm slim i hele fordøjelseskanalen. Den arbejdsgang, der er beskrevet her, muliggør kvantitativ analyse af mikrobiota i den rumlige sammenhæng med værtsmiljøet.
Den protokol, der er beskrevet ovenfor, giver en reproducerbar metode til at visualisere værtsmikrobiotagrænsefladen. Disse analyser har i høj grad nydt godt af protokol udvikling, startende fra optimering af FISH mærkning18 til slim bevarelse og billeddannelse9. Fiksering og indlejring giver også nyttig opbevaring af prøver; desuden kan paraffininfiltrerede kassetter sendes uden begrænsninger, da prøverne er helt faste og inert.
Betydning og alternative metoder
Kombinationen af FISH og slim farvning muliggør analyse af mikrobiota sammensætning på bestemte væv steder og samspillet mellem de enkelte bakterier og værten. Alternative teknikker, der involverer analyse af specifikke steder inden for mikrobiota er normalt ude af stand til at udforske encellet karakter af disse interaktioner, såsom i tilfælde af laser fange mikroissection kombineret med sekventering19. Men, sekventering-baserede teknikker har den fordel at være i stand til at fange den genetiske sammensætning af mikrobiota på et finere niveau og mere bredt end 16S rRNA sonder.
En faldgrube af den præsenterede protokol er, at det giver en enkelt gang snapshot af mikrobiota i forhold til værten. For realtidsbilleddannelse hos levende dyr kræves der særlige billeddannelsesteknikker for at lette erhvervelsen af et fluorescenssignal i dybt væv (f.eks. intravital to-fotonmikroskopi og lysplade fluorescensmikroskopi20,21). I disse metoder er modelorganismen enten koloniseret med bakterier, der er farvet med molekyler, der binder sig til deres konvolut20 eller genetisk modificerede bakterier, der huser fluorescerende proteiner21. I sidstnævnte tilfælde er modningen af fluorescensproteiner et centralt spørgsmål, da de fleste standard fluorescerende proteiner kræver ilt for at udsende lys. Derfor er modelorganismer, der har mindst nanaerobiske miljøer (nanomolarkoncentration af ilt), påkrævet, såsom aerob zebrafisk gut21.
I denne protokol bruges methanol-Carnoy som fiksativ i stedet for paraformaldehyd eller formalin, fordi det ikke indeholder vand. Dette forhindrer hydrering, dehydrering, og sammenbrud af slim lag under behandlingen og letter nøjagtige målinger af slim tykkelse. Mens methacarn fiksering og paraffin indlejring er blevet en standard på området, forskellige fikseringsmidler og indlejring teknikker er blevet undersøgt for at optimere slim bevarelse9,22, med nogle undersøgelser, der tyder på, at harpikser kan være bedre end paraffin indlejring22. En anden vigtig begrænsning for paraffinindlejring og methacarnfiksering er tabet af fluorescerende protein fluorescens, som kan undgås ved hjælp af alternative fikseringsmidler (f.eks. formalin eller paraformaldehyd (PFA)) eller modificerede indlejringsteknikker23. Hvert fiksativ har fordele og ulemper, og valget af fiksativ afhænger af billedprioriteringerne. Billeddannelsesmetoder kan kombineres, hvis biologiske replikater er fastsat i enten PFA og methacarn, og billeder er opnået fra begge prøver.
FISH er blevet kombineret med immunofluorescence i isolerede tilfælde med specifikke anti-Muc2C3 kanin polyklonale antistoffer9,24. Disse resultater er ikke blevet bredt gengivet med andre Muc2 antistoffer, hvilket indikerer, at valget af antistoffer kan være afgørende for succesen af FISH-immunofluorescence kombination. Betingelserne for vellykket antistoffarvning for et givet antistof tillader muligvis ikke tilbageholdelse af FISH farvning.
Fejlfinding
I denne protokol repræsenterer eksempelsamling, sektionsopdelning og farvning vigtige trin for at forhindre oprettelse af billedartefakter. For eksempel kan det at trykke på vævet ved indsamling og før indlejring føre til fejllocalisering af mikrobiota og påvirke slimkvaliteten. En anden vigtig overvejelse er at undgå at kombinere segmenter af meget forskellige tykkelser i en enkelt kassette, såsom et relativt tomt stykke tyndtarmen og en pellet i distale kolon. De forskellige tykkelser fører til vanskeligheder med billeddannelse: Efter indlejring kan tværgående afsnit på en bestemt dybde for et segment være på den forkerte dybde for billeddannelse for den anden (f.eks. vil lumen være på forskellige dybder for hvert væv) (figur 1B, C og figur 3A). Desuden, for billeddannelse dyr model afføring pellets, de kan være pakket ind i peritoneal membran24. I denne teknik foldes en lille del af friskisolerede bughinden forsigtigt rundt om afføringen og bevarer pelletens struktur under vasketrinene skitseret i protokollen.
I modsætning til behandling af animalsk væv med indhold, billeddannelse menneskelige tarmprøver udgør nogle udfordringer. Specifikt, luminalt indhold og slimhinder foring vil sandsynligvis blive forstyrret af koloskopi tarm forberedelse normalt udføres før intestinale biopsier eller resektion procedurer. Derudover, når biopsier indsamles, er det nyttigt at bemærke vævsorientering for at hjælpe med at identificere specifikke træk (f.eks. lumen vs. submucosa) i mangel af tarmindhold. Præ-indlejring med 3% agar og/eller agar:gelatine blandinger kan være nyttige til at opretholde væv polaritet25; der er dog problemer med dehydrering og afsnit af agar, som rapporteret i litteraturen, og behandlingstider kan være nødvendigt at ændre.
Et centralt aspekt for at opnå god FISH farvning kommer fra justering af formamidkoncentrationen for specifikke FISH-sonder. Formamid vil kontrollere hybridisering stringens af FISK sonder til deres mål. Det er vigtigt at sikre, at a) den korrekte formamidkoncentration vælges til farvning af et givet samfund, og b) at en passende formamidkoncentration endda er mulig for sonden kombination, der udnyttes- dette kan påvirke det optimale sondevalg, når du bruger flere sonder. Websteder som mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kan hjælpe med at beregne de korrekte formamidkoncentrationer for en given sonde. I mangel af oplysninger om passende formamidkoncentrationer kan denne protokol testes med 0% og 10% formamid.
Ved at opdele de indlejrede prøver skal blokken skæres så meget ned til at opnå lysende skiver, da en sammenstrækning for lavt ind i en blok vil resultere i et tværsnitsbillede af villi/krypterne uden lysende indhold (figur 3A). Plet prøverne kort efter afsnit for optimalt FISH-signal, og brug frisk DAPI (eller DAPI, der opbevares ved -20 °C) for at løse baggrundsproblemer (Figur 3C). FISH farvning af sektioner, der er mere end en måned gammel kan resultere i dårligere / inkonsekvent farvning.
Hvis væv eller coverlip ikke er helt fladt med hensyn til diaset, er prøven muligvis ikke i fokus på alle positioner i en flisescanning (Figur 3B), hvilket fører til spildt indsats og potentiel fotobleaching. Dette kan løses ved at tage mindre flise scanninger, hvor alle positioner er blevet verificeret at være i fokus. Afsnit med kedelige knive kan også føre til løsrivelse af slim og luminalt indhold, der fremstår som store mørke områder, mens billeddannelse. Endelig kan fordampningen af opløsningen eller boblerne under hybridiseringstrinnet føre til ujævn farvning af FISH-sonderne i vævet.
Et andet kritisk parameter, der påvirker effektiviteten af FISH-sondebindingen, er konkurrencen mellem forskellige sonder. En nyttig kontrol for at kontrollere, at FISH-sonden mærker bakterier, er at undersøge colocalization af signalet fra FISH-sonden med DAPI (Figur 2C, D). I prøver, der kræver brug af flere rRNA-sonder, bliver justering af parametre som hybridiseringstemperatur, sondekoncentration og formamid afgørende for at sikre, at sonderne binder sig effektivt til de korrekte arter18.
Bemærkninger om billedbehandling
FISH-farvede bakterier visualiseres bedst ved hjælp af et konfokalt mikroskop og et mål på mindst 40x forstørrelse. Mens 63x forstørrelse foretrækkes frem for billedbakterier på enkeltcelleniveau, kan 40x forstørrelse også bruges ved at maksimere den digitale zoom eller anvende et superopløsningssystem. Systemer udstyret med super-opløsning kapaciteter kan også give sub-cellulær opløsning af de enkelte bakterieceller. Lavere forstørrelse mål kan udnyttes til at få en generel følelse af bakteriel lokalisering og slim tykkelse.
Erhvervelse af 16-bit billeder i stedet for 8-bit billeder anbefales også stærkt, da det højere dynamikområde vil bidrage til at fange den brede vifte af DAPI-signalet fra de ekstremt lyse kerner af epitelet og det relativt svage signal om lysende bakterier. Bortset fra at bruge billeddannelse setup beskrevet ovenfor, en vigtig billedbehandling overvejelse er valget af fluorophores. For at opnå den bedste adskillelse mellem bakterietyper skal du sikre dig, at de anvendte fluorheste ikke overlapper hinanden i excitation og emissionsspektre (medmindre billeddannelse på et system med evnen til at udføre lineær ubblanding). Derudover kan sonder bruges i kombination (f.eks. kombinationen af en familiespecifik sonde og en slægtsspecifik sonde) til at identificere yderligere communitymedlemmer. Hvis du bruger lineære ublandet eller ugyldige sonder, er det vigtigt at teste nøjagtigheden og niveauet af FISH farvning på rene kulturer8,14.
Når billederne er indsamlet, flere værktøjer er tilgængelige for den kvantitative analyse af værten-mikrobiota interface, såsom BacSpace26, HiPR-FISH8, og andre segmentering værktøjer27. BacSpace er en MATLAB-software, der gør det muligt at segmentere vævs- og luminalkomponenterne og fjerne plantemateriale fra images26. Programmet giver også analyse af slim tykkelse i 2D og kvantificering af rumlige fordeling baseret på pixel afstande i forskellige kanaler26. Omvendt tillader HiPR-FISH Image Analysis-softwaren segmentering af FISH-farvede celler8. Endelig kunne andre bakterielle segmenteringsværktøjer, der er optimeret til in vitro-eksperimenter27, også tilpasses denne applikation.
Konklusion
In situ imaging muliggør kvantitativ analyse af individuelle mikrobielle taxa i forbindelse med andre medlemmer af samfundet og de forskellige mikromiljø skabt af kost, slim, og vært epitel krypter. Samspillet mellem organismer dikterer biologien af værtsrelaterede mikrobielle systemer og giver en væsentlig analyse af ændringer i disse strukturer under forstyrrelser, der har konsekvenser for helbredet. Især giver evnen til at afbilde mikrobiota in situ gennem protokollen beskrevet ovenfor et utroligt vindue ind i mikrobiotaens biogeografi i forhold til dyreværten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Kristen Earle for uvurderlig teknik udvikling, Amber Hann for fejlfinding hjælp, Dr. Jen Nguyen og Deanna Pepin for kritisk gennemgang af manuskriptet, og Dr. Hesham Soliman og Rossi lab på University of British Columbia for at give mikroskop adgang. Forfatterne anerkender støtte fra CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohns og Colitis Canada (til C.T. og K.M.N.), CIFAR (til C.T. og K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (til C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (til C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (til C.T.).
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |