Plataforma de cultivo de órganos del segmento anterior para el seguimiento de lesiones de globo abierto y rendimiento terapéutico
Summary
Las lesiones oculares de globo abierto pueden no tratarse durante varios días en escenarios rurales o militares relevantes, lo que resulta en ceguera. Se necesitan terapias para minimizar la pérdida de visión. Aquí, detallamos un modelo de lesión de globo abierto de cultivo de órganos. Con este modelo, las posibles terapias para estabilizar estas lesiones pueden evaluarse adecuadamente.
Abstract
Las lesiones de globo abierto tienen malos resultados visuales, lo que a menudo resulta en una pérdida permanente de la visión. Esto se debe en parte a un retraso prolongado entre las lesiones y la intervención médica en entornos rurales y aplicaciones de medicina militar donde la atención oftálmica no está fácilmente disponible. Las lesiones no tratadas son susceptibles a la infección después de que el ojo ha perdido su sello estanco, así como a la pérdida de viabilidad del tejido debido a la hipotensión intraocular. Las terapias para sellar temporalmente las lesiones del globo abierto, si se desarrollan adecuadamente, pueden restaurar la presión intraocular y prevenir la infección hasta que sea posible la atención oftálmica adecuada. Para facilitar el desarrollo del producto, aquí se detalla el uso de una plataforma de lesión de globo abierto de cultivo de órganos del segmento anterior para rastrear el rendimiento terapéutico durante al menos 72 h después de la lesión. El tejido del segmento anterior porcino se puede mantener en platos de cultivo de órganos diseñados a medida y mantenerse a presión intraocular fisiológica. Las lesiones por punción se pueden crear con un sistema neumático capaz de generar tamaños de lesión de hasta 4,5 mm de diámetro, similares a los tamaños de lesión relevantes para el ejército. La pérdida de presión intraocular se puede observar durante 72 h después de la lesión, lo que confirma la inducción adecuada de la lesión y la pérdida del sello estanco del ojo. El rendimiento terapéutico se puede rastrear mediante la aplicación al ojo después de la inducción de la lesión y luego el seguimiento de la presión intraocular durante varios días. Además, el modelo de lesión del segmento anterior es aplicable a los métodos ampliamente utilizados para el seguimiento funcional y biológico de la fisiología del segmento anterior, como la evaluación de la transparencia, la mecánica ocular, la salud del epitelio corneal y la viabilidad de los tejidos. En general, el método descrito aquí es un siguiente paso necesario hacia el desarrollo de terapias de biomateriales para sellar temporalmente las lesiones de globo abierto cuando la atención oftálmica no está fácilmente disponible.
Introduction
Las lesiones de globo abierto (OG) pueden resultar en una pérdida permanente de la visión cuando no se tratan o al menos se estabilizan después deuna lesión 1. Sin embargo, los retrasos prevalecen en áreas remotas donde el acceso a la intervención oftálmica no está fácilmente disponible, como en áreas rurales o en el campo de batalla en escenarios militares. Cuando el tratamiento no está fácilmente disponible, el estándar actual de atención es proteger el ojo con un escudo rígido hasta que sea posible la intervención médica. En medicina militar, este retraso es actualmente de hasta 24 h, pero se prevé que aumente hasta 72 h en futuras operaciones de combate en entornos urbanos donde no es posible la evacuación aérea2,3,4. Estos retrasos pueden ser aún más largos en aplicaciones civiles rurales y remotas donde el acceso a la intervención oftálmica es limitado5,6. Una lesión OG no tratada es altamente susceptible a la infección y la pérdida de presión intraocular (PIO) debido a que el sello estanco del ojo se ve comprometido7,8. La pérdida de PIO puede afectar la viabilidad del tejido, por lo que es poco probable que cualquier intervención médica restaure la visión si el retraso entre la lesión y la terapéutica es demasiado largo9.
Para permitir el desarrollo de terapias fáciles de aplicar para sellar lesiones OG hasta que se pueda llegar a un especialista oftálmico, se desarrolló previamente un modelo de lesión OG de sobremesa10,11. Con este modelo, se crearon lesiones de alta velocidad en ojos porcinos enteros, mientras que la PIO fue capturada por transductores de presión. La terapéutica se puede aplicar para evaluar su capacidad para sellar el sitio de la lesión OG12. Sin embargo, como este modelo utiliza ojos porcinos enteros, solo puede evaluar el rendimiento terapéutico inmediato sin forma de rastrear el rendimiento a largo plazo en la posible ventana de 72 horas en la que el terapéutico debe estabilizar el sitio de la lesión hasta que el paciente llegue a la atención especializada. Como resultado, se desarrolló un modelo de lesión OG de cultivo de órganos del segmento anterior (ASOC) y se detalló en este protocolo como plataforma para el seguimiento del rendimiento terapéutico a largo plazo13.
ASOC es una técnica ampliamente utilizada para mantener el tejido avascular del segmento anterior, como la córnea, durante varias semanas después de la enucleación14,15,16,17. El segmento anterior se mantiene bajo PIO fisiológica mediante la perfusión de líquido a caudales fisiológicos y la preservación de la región de salida de malla trabecular, el tejido responsable de regular la PIO, durante la configuración de ASOC18,19. La plataforma ASOC puede mantener el tejido fisiológicamente, inducir una lesión OG utilizando un dispositivo neumático, aplicar una terapéutica y rastrear la estabilización de la lesión durante al menos 72 h después dela lesión 13.
Aquí, el protocolo proporciona una metodología paso a paso para usar la plataforma ASOC. Primero detalla cómo configurar y fabricar la plataforma ASOC. A continuación, el protocolo detalla cómo diseccionar asépticamente el segmento anterior y mantener la malla trabecular, seguido de la configuración del tejido del segmento anterior en platos de cultivo de órganos personalizados. Luego, detalla cómo crear lesiones de globo abierto y aplicar terapias inmediatamente después de la lesión. Por último, el protocolo proporciona una visión general sobre los parámetros de caracterización que son posibles de usar con este método que evalúa las propiedades funcionales, mecánicas y biológicas del ojo y qué tan bien se estabilizó la lesión. En general, este modelo proporciona una plataforma muy necesaria para acelerar el desarrollo de productos para estabilizar y tratar lesiones de globo abierto y mejorar el mal pronóstico de la visión después de una lesión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay pasos críticos con la plataforma de lesiones ASOC OG que deben destacarse para mejorar la probabilidad de éxito al usar la metodología. En primer lugar, durante la disección del segmento anterior, preservar la malla trabecular es esencial pero difícil de hacer correctamente. Si la MT se interrumpe, el ojo no mantendrá la presión fisiológica y no cumplirá con los criterios de elegibilidad para el uso experimental. Se recomienda practicar primero el proceso de disección en condiciones normales en lugar de int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material se basa en el trabajo apoyado por el Departamento de Defensa de los Estados Unidos a través de un acuerdo interinstitucional (# 19-1006-IM) con el programa de adquisición de Reparación Corneal Temporal (Agencia de Desarrollo de Material Médico del Ejército de los Estados Unidos).
Materials
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
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