שיפור פלואורסצנטיות המושרה בחלבון המושרה בחלבון בזמן הוא חיישן קרבה פלואורסצנטי שימושי רגיש לשינויים מבניים מקומיים בחלבונים. כאן אנו מראים שניתן להשתמש בו כדי לחשוף קונפורמציות מקומיות יציבות α-Synuclein, אשר ידוע גם בשם globulared ולא יציב כאשר נמדד באמצעות סרגל FRET לטווח ארוך יותר.
שימוש בסרגלים ספקטרוסקופיים כדי לעקוב אחר קונפורמציות מרובות של ביומולקולות בודדות והדינמיקה שלהם חוללה מהפכה בהבנת הדינמיקה המבנית ותרומתה לביולוגיה. בעוד שהסרגל מבוסס FRET מדווח על מרחקים בין צבעים בטווח של 3-10 ננומטר, טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות, כגון שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון (PIFE), מדווחות על הקרבה בין צבע למשטח חלבון בטווח הקצר יותר של 0-3 ננומטר. ללא קשר לשיטת הבחירה, השימוש בו במדידת ביו-מולוקולים המפזרים בחופשיות בזה אחר זה מאחזר היסטוגרמה של הפרמטר הניסיוני המניב אוכלוסיות תת-אוכלוסיות נפרדות בחלוקה מרכזית של ביו-מוקולות, כאשר כל תת-אוכלוסייה מייצגת התאמה אחת שנותרה ללא שינוי בתוך אלפיות השניה, או קונפורמציות מרובות המתחברות הרבה יותר מהר מאלפיות שניה, ומכאן תת-אוכלוסייה ממוצעת. במולקולה אחת FRET, שבו הפרמטר המדווח בהיסטוגרמה הוא יעילות FRET בין צבעים, חלבון הפרעה מהותית, כגון מונומר α-Synuclein במאגר, דווח בעבר כמפגין תת-אוכלוסייה ממוצעת אחת של קונפורמציות מרובות המתחברות במהירות. בעוד שממצאי העבר האלה תלויים בטווח של 3-10 ננומטר של השליט מבוסס FRET, ביקשנו לשים את החלבון הזה במבחן באמצעות PIFE של מולקולה אחת, שם אנו עוקבים אחר חיי הפלואורסצנטיות של חלבוני α-Synuclein ספציפיים לאתר. מעניין, באמצעות חיישן קרבה ספקטרוסקופי לטווח קצר זה, sCy3-תווית α-Synuclein מציג מספר אוכלוסיות משנה לכל החיים עם תקופות חיים ממוצעות שונות במובהק כי interconvert ב 10-100 ms. תוצאות אלה מראות כי בעוד α-Synuclein עלול להיות מופרע ברחבי העולם, הוא בכל זאת משיג מבנים מקומיים יציבים. לסיכום, בעבודה זו אנו מדגישים את היתרון של שימוש בחיישני קרבה ספקטרוסקופיים שונים העוקבים אחר שינויים מבניים מקומיים או גלובליים ביומולקול אחד בכל פעם.
במהלך שני העשורים האחרונים, שיטות מבוססות פלואורסצנטיות של מולקולה אחת הפכו לכלי רב עוצמה למדידת ביומולקולות1,2, בודקים כיצד פרמטרים ביומולקולריים שונים מפיצים, כמו גם כיצד הם מתחברים באופן דינמי בין אוכלוסיות משנה שונות שלפרמטריםאלה ברזולוציה תת-אלפית השנייה 3,4,5. הפרמטרים בטכניקות אלה כוללים את יעילות העברת האנרגיה במדידות FRET 6,7, פלואורסצנטיות אניזוטרופיה8,9, פלואורסצנטיות תשואות קוונטיות ואורך חיים10,11, כפונקציה של פלואורסצנטיות שונה מרווה12 או שיפור13 מנגנונים. אחד ממנגנונים אלה, הידוע יותר בשם שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי חלבון (PIFE)14 מציג את השיפור של תשואה קוונטית פלואורסצנטית ואורך חיים כפונקציה של חסימה סטרית לאיזומריזציה חופשית של הפלואורופור כאשר במצב נרגש, הנגרמת על ידי משטחי חלבון בקרבת הצבע14,15,16,17,18,19 . הן FRET והן PIFE נחשבים לשליטים ספקטרוסקופיים או חיישני קרבה מכיוון שהפרמטר הנמדד שלהם מקושר ישירות למדידה מרחבית בתוך הביומולקול המסומן תחת מדידה. בעוד יעילות FRET קשורה למרחק בין זוג צבעים בטווח של 3-10 ננומטר20, PIFE עוקב אחר עלייה בתפוקות קוונטיות פלואורסצנטיות או תקופות חיים הקשורות למרחק בין הצבע לבין משטח של חלבון סמוך בטווח של 0-3 ננומטר19.
FRET מולקולה אחת שימשה באופן נרחב למתן תובנות מבניות למערכות חלבון רבות ושונות, כולל חלבונים עם הפרעה מהותית (עקורים)21, כגון α-סינוקלאין (α-Syn)22. α-Syn יכול ליצור מבנים מסודרים בעקבות קשירה ביומולקולים שונים ובתנאים שונים23,24,25,26,27,28,29,30. עם זאת, כאשר לא מאוגד, מונומר α-Syn מאופיין בהטרוגניות קונפורמציה גבוהה עם קונפורמציות הדדיות במהירות31,32.
הקונפורמציות של α-Syn נחקרו בעבר באמצעות טכניקות שונות ושונות המסייעות בזיהוי דינמיקה קונפורמיאלית של מערכות חלבון הטרוגניות ודינמיות כאלה33,34,35,36,37,38,39. מעניין, מדידות FRET מולקולה אחת (smFRET) של α-Syn במאגר דיווחו על אוכלוסיית FRET יחיד39,40 כי הוא תוצאה של זמן ממוצע של קונפורמציות באופן דינמי interconverting לפעמים הרבה יותר מהר מאשר זמן דיפוזיה טיפוסי של α-Syn דרך נקודת הקונפוקציה (פעמים מהר כמו מיקרו שניות מעטות ואפילו מהר יותר מזה, יחסית זמני דיפוזיה אלפיות השנייה טיפוסית)40, 41. עם זאת, באמצעות סרגל ספקטרוסקופי FRET עם רגישות למרחק של 3-10 ננומטר מדווח לפעמים רק על שינויים מבניים כוללים בחלבון קטן כגון α-Syn. למדידות של מולקולה אחת המשתמשות בחיישני קרבה ספקטרוסקופיים עם רגישויות מרחק קצרות יותר יש פוטנציאל לדווח על דינמיקה של מבנים מקומיים. בזאת אנו מבצעים מדידות PIFE של α-Syn ומזהים תת-אוכלוסיות שונות של מיפוי אורך חיים פלואורסצנטי למבנים מקומיים שונים עם מעברים ביניהם איטיים כמו 100 אלפיות שני. עבודה זו מסכמת מדידות smPIFE שנפתרו בזמן של מולקולות α-Syn המתפזרות בחופשיות אחת בכל פעם, במאגר וכאשר היא מאוגדת לממברנות מבוססות SDS כחיישן קרבה ספקטרוסקופי לטווח קצר.
מחקרים ביוכימיים וביופיזיים נרחבים בוצעו כדי לחקור את המאפיינים המבניים של α-Syn וטבעו המופרע33,34,35,36,37,38. מספר עבודות כבר השתמשו ב- smFRET המתפזר בחופשיות כדי לחקור את הדינמיקה התוך-מול?…
The authors have nothing to disclose.
ה-pT-t7 קידוד A56C α-Syn ניתנה לנו במתנה מד”ר אסף גרופי, ד”ר דן אמיר וד”ר אלישע האס. מאמר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH, מענק R01 GM130942 לא”ל כסובה), הקרן הישראלית למדע (מענק 3565/20 במסגרת תוכנית קילקורונה – בלימת נגיף הקורונה), קרן מילנר והאוניברסיטה העברית בירושלים (קרנות הזנק).
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merc | C7715 | cutoff: 100 kDa |
ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | |
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube | Gene Bio-Application | MEGA320 | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Fast SeeBand staining solution | Gene Bio-Application | SB050 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
HiTrap Desalting 5 mL | Sigma-Aldrich | GE17-1408 | |
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
LB broth | Sigma-Aldrich | L3152 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | |
MonoQ column | Sigma-Aldrich | 54807 | |
protein LoBind tube | Sigma-Aldrich | EP0030108094 | 0.5 mL |
Rinse a µ-slide 18 | Ibidi | 81816 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 75746 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 | |
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas | mini-plast | 815-004-05-001 | |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
sulfo-Cy3 maleimide | abcam | ab146493 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | 75259 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 93363 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |