Усиление флуоресценции с одномолекулярным белком, индуцированным временем, является полезным флуоресцентным спектроскопическим датчиком приближения, чувствительным к локальным структурным изменениям в белках. Здесь мы показываем, что он может быть использован для выявления стабильных локальных конформаций в α-синуклеине, который иначе известен как глобулярно неструктурированный и нестабильный при измерении с использованием линейки FRET с более длинным диапазоном.
Использование спектроскопических линеек для отслеживания множественных конформаций отдельных биомолекул и их динамики произвело революцию в понимании структурной динамики и ее вклада в биологию. В то время как линейка на основе FRET сообщает о межкрасивых расстояниях в диапазоне 3-10 нм, другие спектроскопические методы, такие как усиление флуоресценции, индуцированное белком (PIFE), сообщают о близости между красителем и поверхностью белка в более коротком диапазоне 0-3 нм. Независимо от выбранного метода, его использование при измерении свободно-диффузных биомолекул по одной за раз извлекает гистограммы экспериментального параметра, дающие отдельные централизованно распределенные субпуляции биомолекул, где каждая субоплюдион представляет собой либо единую конформацию, которая оставалась неизменной в течение миллисекунд, либо множественные конформации, которые взаимопреобразуются намного быстрее миллисекунд, и, следовательно, усредненную субпуляцию. В одномолекулярном FRET, где сообщаемым параметром в гистограммах является эффективность FRET между красителями, внутренне неупорядоцированный белок, такой как мономер α-синуклеина в буфере, ранее сообщал как демонстрирующий одну усредненную субпопуляцию множественных конформаций, быстро взаимопреобразующихся. Хотя эти прошлые результаты зависят от диапазона 3-10 нм линейки на основе FRET, мы стремились проверить этот белок с использованием одномолекулярного PIFE, где мы отслеживаем время жизни флуоресценции сайтов-специфических α-синуклеиновых белков sCy3 по одному. Интересно, что используя этот спектроскопический датчик приближения с более коротким диапазоном, меченый sCy3 α-Synuclein демонстрирует несколько подпопущений времени жизни с совершенно разными средними сроками жизни, которые взаимоконвертируются за 10-100 мс. Эти результаты показывают, что, хотя α-синуклеин может быть неупорядочешен в глобальном масштабе, он, тем не менее, достигает стабильных местных структур. Таким образом, в этой работе мы подчеркиваем преимущество использования различных спектроскопических датчиков приближения, которые отслеживают локальные или глобальные структурные изменения по одной биомолекуле за раз.
За последние два десятилетия одномолекулярные флуоресцентные методы стали мощным инструментом для измерения биомолекул1,2,исследования того, как распределяются различные биомолекулярные параметры, а также как они динамически взаимоконвертируются между различными субопциплонатами этих параметров при субмиллисекундном разрешении3,4,5. Параметры в этих методах включают эффективность передачи энергии в измерениях FRET 6,7,флуоресцентную анизотропию8,9,квант флуоресценции и время жизни10,11,как функцию различных флуоресцентных гасящих12 или13 улучшений механизмов. Один из этих механизмов, более известный как белково-индуцированное флуоресцентное усиление (PIFE)14, вводит увеличение квантового выхода флуоресценции и времени жизни в функции стерической обструкции к свободной изомеризации флуорофора в возбужденном состоянии, вызванном белковыми поверхностями в непосредственной близости от красителя14,15,16,17,18,19 . Как FRET, так и PIFE считаются спектроскопическими линейками или датчиками приближения, поскольку их измеряемый параметр напрямую связан с пространственной мерой в меченой биомолекуле при измерении. В то время как эффективность FRET связана с расстоянием между парой красителей в диапазоне 3-10 нм20,треки PIFE увеличивают квантовые выходы флуоресценции или время жизни, связанное с расстоянием между красителем и поверхностью соседнего белка в диапазоне 0-3 нм19.
Одномолекулярный FRET широко используется для обеспечения структурного понимания многих различных белковых систем, включая внутренне неупорядоженные белки (IMP)21,такие как α-synuclein (α-Syn)22. α-Syn может образовывать упорядоченные структуры после связывания с различными биомолекулами и в разных условиях23,24,25, 26,27,28,29,30. Однако при несвязывке мономер α-Syn характеризуется высокой конформационной гетерогенностью с быстро взаимоконвертируемыми конформациями31,32.
Конформации α-Syn были изучены ранее с использованием различных методов, которые помогают в выявлении конформационной динамики таких высоко гетерогенных и динамических белковых систем33,34,35,36,37,38,39. Интересно, что одномолекулярные измерения FRET (smFRET) α-Syn в буфере сообщили об одной популяции FRET39,40, что является результатом усреднения по времени конформаций, динамически взаимопреобразующихся в разы намного быстрее, чем типичное время диффузии α-Syn через конфокальное пятно (в разы быстрее, чем несколько микросекунд и даже быстрее, чем это, относительно типичного миллисекундного времени диффузии)40, 41г. Однако использование спектроскопической линейки FRET с чувствительностью расстояния 3-10 нм иногда сообщает только об общих структурных изменениях в небольшом белке, таком как α-Syn. Одномолекулярные измерения с использованием спектроскопических датчиков приближения с более короткой чувствительностью расстояния могут сообщить о динамике локальных структур. При этом мы выполняем одномолекулярные измерения PIFE α-Syn и идентифицируем различные субпопущенности флуоресцентных жизней, отображающих различные локальные структуры с переходами между ними медленно до 100 мс. В этой работе обобщены измерения smPIFE со временным разрешением свободно диффундируемых молекул α-Syn по одной, в буфере и при связываниях с мембранами на основе SDS в качестве одномолекулярного спектроскопического датчика приближения малого диапазона.
Проведены обширные биохимические и биофизические исследования для изучения структурных характеристик α-Син и его неупорядоченной природы33, 34,35,36,37,38. В нескольких работах уже ис…
The authors have nothing to disclose.
Плазмида pT-t7, кодировавщая A56C α-Syn мутант, была подарена нам доктором Асафом Групи, доктором Дэном Амиром и доктором Элишей Хаасом. Эта статья была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH, грант R01 GM130942 для E.L. в качестве субавадры), Израильским научным фондом (грант 3565/20 в рамках программы KillCorona – Сдерживание коронавируса), Фондом Милнера и Еврейским университетом Иерусалима (стартовые фонды).
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merc | C7715 | cutoff: 100 kDa |
ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | |
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube | Gene Bio-Application | MEGA320 | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Fast SeeBand staining solution | Gene Bio-Application | SB050 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
HiTrap Desalting 5 mL | Sigma-Aldrich | GE17-1408 | |
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
LB broth | Sigma-Aldrich | L3152 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | |
MonoQ column | Sigma-Aldrich | 54807 | |
protein LoBind tube | Sigma-Aldrich | EP0030108094 | 0.5 mL |
Rinse a µ-slide 18 | Ibidi | 81816 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 75746 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 | |
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas | mini-plast | 815-004-05-001 | |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
sulfo-Cy3 maleimide | abcam | ab146493 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | 75259 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 93363 | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |