रिबोसोम प्रोटीन संश्लेषण का एकल अणु फ्लोरेसेंस एनर्जी ट्रांसफर अध्ययन
Summary
एकल अणु फ्लोरेसेंस ऊर्जा हस्तांतरण एक विधि है जो रिबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण के दौरान ट्रान की गतिशीलता को ट्रैक करती है। व्यक्तिगत राइबोसोम्स को ट्रैक करके, अउमेन्तर आबादी की पहचान की जाती है, जो तंत्र पर प्रकाश डाला जाता है। इस विधि का उपयोग सामान्य रूप से जैविक अनुरूप परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है ताकि कई अन्य जटिल बायोसिस्टम में गतिशील-कार्य संबंधों को प्रकट किया जा सके। एकल अणु विधियां गैर-दर-दर सीमित चरणों और कम आबादी वाले प्रमुख मध्यवर्ती का निरीक्षण कर सकती हैं, जो औसत प्रभाव के कारण पारंपरिक पहनावा विधियों द्वारा सुलभ नहीं हैं।
Abstract
राइबोसोम एक बड़ा राइबोन्यूलोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो एमआरएनए टेम्पलेट्स के साथ प्रोटीन को प्रोसेसिक रूप से असेंबल करता है। राइबोसोम का व्यास ए-, पी-और ई-साइटों पर बड़े टीआरएनए सब्सट्रेट्स को समायोजित करने के लिए लगभग 20 एनएम है। नतीजतन, राइबोसोम गतिशीलता स्वाभाविक रूप से जल्दी से चरणबद्ध रूप से डी-चरणबद्ध होती है। एकल अणु विधि प्रत्येक राइबोसोम का अलग से पता लगा सकती है और असंगत आबादी को अलग कर सकती है, जो बहु-घटक प्रणालियों के जटिल तंत्र को प्रकट करने के लिए आवश्यक है। हम राइबोसोमल प्रोटीन L27 और tRNAs के बीच राइबोसोम गतिशीलता की जांच करने के लिए निकॉन Ti2 उल्टे माइक्रोस्कोप पर आधारित एक smFRET विधि के विवरण की रिपोर्ट करते हैं । L27 अपनी अनूठी Cys ५३ स्थिति पर लेबल और एक राइबोसोम है कि L27 कमी इंजीनियर है में पुनर्गठन किया है । TRNA अपने कोहनी क्षेत्र में लेबल है । चूंकि ट्रानई विस्तार चक्र के दौरान राइबोसोम के अंदर विभिन्न स्थानों पर जाती है, जैसे कि पूर्व और बाद के स्थानांतरण, FRET क्षमता और गतिशीलता अंतर प्रदर्शित करते हैं, जिन्होंने कई उप-आबादी का सुझाव दिया है। ये उपआबादी कलाकारों की टुकड़ी के तरीकों से पता लगाने योग्य नहीं हैं। टीआईआरएफ आधारित एसएमएफईटी माइक्रोस्कोप एक मैनुअल या मोटराइज्ड उल्टे माइक्रोस्कोप पर बनाया गया है, जिसमें घर में बने लेजर रोशनी होती है । राइबोसोम नमूनों को अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा शुद्ध किया जाता है, जो घर में निर्मित बहु-चैनल नमूना सेल में लोड होता है और फिर एक इवांसेंट लेजर क्षेत्र के माध्यम से प्रकाशित होता है। प्रतिबिंब लेजर स्पॉट सही ध्यान का प्रतिक्रिया नियंत्रण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फ्लोरेसेंस सिग्नल एक मोटराइज्ड फिल्टर-बुर्ज से अलग होते हैं और दो डिजिटल सीएमओएस कैमरों द्वारा एकत्र किए जाते हैं। तीव्रता एनआईएस-तत्व सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं ।
Introduction
राइबोसोम एक बड़े (50S) और एक छोटे (30S) सबयूनिट का ø 20 एनएम बड़ा राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन परिसर है। यह एमआरएनए टेम्पलेट के साथ लंबे पेप्टाइड्स को प्रक्रियात्मक रूप से और सहकारी रूप से इकट्ठा करता है। राइबोसोम 30S प्रोटीन संश्लेषण शुरू करने के लिएfMet-tRNA fMet और mRNA से बांधता है, और 50S तब 70 के दशक दीक्षा परिसर बनाने में शामिल होता है। टीआरएनए ए-साइट (अमीनोएसिल-टीआरएनए बाइंडिंग साइट) पर राइबोसोम में अमीनो एसिड लाते हैं, जबकि लम्बी पेप्टिडिल श्रृंखला पी-साइट (पेप्टिडिल-टीआरएनए बाध्यकारी साइट) पर आयोजित की जाती है। पूर्व-स्थानांतरण परिसर में, पेप्टिडाइल चेन को एक अमीनो एसिड के साथ ए-साइट पर टीआरएनए में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस बीच, पी साइट tRNA deacylated है । फिर, ए-, पी-ट्रान्सए पोस्ट-ट्रांसलोकेशन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए पी-, ई-साइट्स पर जाते हैं, जिसमें ई-साइट ट्रानओन एग्जिट साइट का प्रतिनिधित्व करता है । इस राज्य में, पेप्टिडिल-ट्रान वापस पी-साइट पर जाता है। विस्तार चक्र पूर्व और बाद के अनुरूपता के बीच जारी है, जबकि राइबोसोम एमआरएनए पर ट्रांसलॉकेट करता है, एक समय में एक कोडन1। राइबोसोम इस प्रक्रिया को कुशल और सटीक बनाने के लिए विभिन्न कार्यात्मक स्थलों का अत्यधिक समन्वय है, जैसे इंटर-सब-सबयूनिट रैचेटिंग2,ट्रान्स हाइब्रिडाइजेशन में उतार-चढ़ाव3,जीटीपीई एक्टिवेशन4,एल1 डंठल खोलने-समापन5,आदि। नतीजतन, राइबोसोम जल्दी से डी-फेज करते हैं क्योंकि हर अणु अपनी गति से चलता है। पारंपरिक तरीके केवल स्पष्ट औसत मापदंडों को कम कर सकते हैं, लेकिन कम आबादी वाली या अल्पकालिक प्रजातियों को औसत प्रभाव6में नकाबपोश किया जाएगा। एकल अणु विधि व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक राइबोसोम का पता लगाकर इस सीमा को तोड़ सकती है, फिर सांख्यिकीय पुनर्निर्माण7के माध्यम से विभिन्न प्रजातियों की पहचान कर सकती है। राइबोसोम गतिशीलता की जांच के लिए विभिन्न लेबलिंग साइटों को लागू किया गया है, जैसे कि ट्रान-ट्रान8,ईएफ-जी-एल119,एल1-ट्रान10आदि के बीच बातचीत। इसके अलावा, बड़ी और छोटी उपइकाओं को लेबल करके, क्रमशः, इंटर-सब-सबयूनिट रैचेटेड काइनेटिक्स और कारकों के साथ समन्वय11,12मनाया जाता है। इस बीच, smFRET विधि अन्य केंद्रीय जैविक प्रक्रियाओं में व्यापक अनुप्रयोगों है, और बहु रंग FRET तरीकों13उभर रहे हैं ।
पहले एक उपन्यास राइबोसोम एफर्ट जोड़ी14,15विकसित की गई थी । रिकॉम्बिनेंट राइबोसोमल प्रोटीन एल27 को व्यक्त किया गया है, शुद्ध किया गया है, और लेबल किया गया है, और राइबोसोम में वापस शामिल किया गया है। इस प्रोटीन ने एक करीबी दूरी पर टीआरएनए के साथ बातचीत की और स्थानांतरण के बाद परिसर में पी-साइट टीआरएनए को स्थिर करने में मदद की। जब ट्रान ए-से पी-साइट पर चले जाते हैं, तो इस प्रोटीन और ट्रान के बीच की दूरी को छोटा कर दिया जाता है, जिसे smFRET सिग्नल द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। सांख्यिकीय विधियों और म्यूटेनेसिस का उपयोग करके कई राइबोसोम उप-आबादी की पहचान की गई है, और पूर्व में इन आबादी के सहज आदान-प्रदान के बाद नहीं, लेकिन बाद के स्थानांतरण परिसर से पता चलता है कि राइबोसोम एमआरएनए पर जाने से पहले अधिक लचीला है, और16, 17,18को डिकोडिंग केदौरानअधिक कठोर है। ये विविधताएं राइबोसोम फ़ंक्शन के लिए आवश्यक हैं। यहां, प्रोटोकॉल राइबोसोम/tRNA-लेबलिंग, राइबोसोम में उनके निगमन, smFRET नमूना तैयारी, और डेटा अधिग्रहण/विश्लेषण19के विवरण का वर्णन करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
SMFRET पृष्ठभूमि संकेतों के प्रति संवेदनशील है। सबसे पहले, 0.05% ट्वीन के साथ नमूना कक्ष को कोट करना आवश्यक है और फिर सतह पर राइबोसोम के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करने के लिए राइबोसोम समाधान के साथ समव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01GM1111452) और वेल्च फाउंडेशन (ई-1721) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
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