Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas
Summary
La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar pasos no limitantes de velocidad e intermedios clave poco poblados, a los que no son accesibles los métodos de conjunto convencionales debido al efecto promedio.
Abstract
El ribosoma es un gran complejo de ribonucleoproteínas que ensambla proteínas procesivamente a lo largo de plantillas de ARNm. El diámetro del ribosoma es de aproximadamente 20 nm para acomodar grandes sustratos de ARNt en los sitios A, P y E. En consecuencia, la dinámica del ribosoma se desesfálice naturalmente rápidamente. El método de molécula única puede detectar cada ribosoma por separado y distinguir poblaciones no homogéneas, lo cual es esencial para revelar los complicados mecanismos de los sistemas de múltiples componentes. Informamos los detalles de un método smFRET basado en el microscopio invertido Nikon Ti2 para sondear la dinámica de los ribosomas entre la proteína ribosómica L27 y los ARNt. El L27 está etiquetado en su posición única Cys 53 y reconstituido en un ribosoma que está diseñado para carecer de L27. El ARNt está etiquetado en la región del codo. A medida que el ARNt se mueve a diferentes ubicaciones dentro del ribosoma durante el ciclo de elongación, como la pre y post-translocación, las eficiencias y dinámicas de FRET exhiben diferencias, lo que ha sugerido múltiples subpoblaciones. Estas subpoblaciones no son detectables por métodos de conjunto. El microscopio smFRET basado en TIRF está construido sobre un microscopio invertido manual o motorizado, con iluminación láser casera. Las muestras de ribosomas se purifican mediante ultracentrifugación, se cargan en una célula de muestra multicanal construida en casa y luego se iluminan a través de un campo láser evanescente. El punto láser de reflexión se puede utilizar para lograr el control de retroalimentación del enfoque perfecto. Las señales de fluorescencia están separadas por una torreta de filtro motorizada y recogidas por dos cámaras CMOS digitales. Las intensidades se recuperan a través del software NIS-Elements.
Introduction
El ribosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande de ø 20 nm de una subunidad grande (50S) y una pequeña (30S). Ensambla péptidos largos a lo largo de la plantilla de ARNm de manera procesiva y cooperativa. El ribosoma 30S se une al fMet-tRNAfMet y al ARNm para iniciar la síntesis de proteínas, y el 50S luego se une para formar el complejo de iniciación 70S. Los ARNt llevan aminoácidos al ribosoma en el sitio A (sitio de unión aminoacil-ARNt), mientras que la cadena peptidilada alargada se mantiene en el sitio P (sitio de unión peptidil-ARNt). En el complejo de pre-translocación, la cadena de peptidil se transfiere al ARNt en el sitio A con un aminoácido añadido. Mientras tanto, el ARNt del sitio P está desacilado. Luego, los ARNt A-, P- se mueven a los sitios P-, E- para formar el complejo post-translocación, en el que el sitio E representa el sitio de salida del ARNt. En este estado, el PEPTIDIL-ARNt se mueve de vuelta al sitio P. El ciclo de elongación continúa entre las pre y postconformaciones mientras que el ribosoma se transloca en el ARNm, un codón a la vez1. El ribosoma es altamente coordinativo de diferentes sitios funcionales para hacer que este proceso sea eficiente y preciso, como el trinquete intersubunidad2,las fluctuaciones de hibridación de ARNt3,las activaciones de GTPasa4,la apertura-cierre del tallo L15,etc. En consecuencia, los ribosomas se desespaspas rápidamente porque cada molécula se mueve a su propio ritmo. Los métodos convencionales solo pueden deducir parámetros medios aparentes, pero las especies poco pobladas o de corta duración se enmascararán en el efecto medio6. El método de molécula única puede romper esta limitación detectando cada ribosoma individualmente, luego identificar diferentes especies a través de la reconstrucción estadística7. Se han implementado diferentes sitios de etiquetado para sondear la dinámica de los ribosomas, como las interacciones entre tRNA-ARNt8,EF-G-L119,L1-ARNt10,etc. Además, al etiquetar las subunidades grandes y pequeñas, respectivamente, se observa la cinética de trinquete entre subunidades y la coordinación con los factores11,12. Mientras tanto, el método smFRET tiene amplias aplicaciones en otros procesos biológicos centrales, y están surgiendo métodos FRET multicolor13.
Anteriormente se desarrolló un nuevo par de RIBOSOMAS FRET14,15. La proteína ribosómica recombinante L27 ha sido expresada, purificada y etiquetada, e incorporada de nuevo al ribosoma. Esta proteína interactuó con los ARNt a corta distancia y ayudó a estabilizar el ARNt del sitio P en el complejo post-translocación. Cuando el ARNt se mueve del sitio A- al P, la distancia entre esta proteína y el ARNt se acorta, lo que puede distinguirse por la señal smFRET. Se han identificado múltiples subpoblaciones de ribosomas utilizando métodos estadísticos y mutagénesis, y el intercambio espontáneo de estas poblaciones en el complejo pre- pero no post- translocación sugiere que el ribosoma es más flexible antes de moverse sobre el ARNm, y más rígido durante la decodificación16,17,18. Estas variaciones son esenciales para la función del ribosoma. Aquí, el protocolo describe los detalles del etiquetado ribosómico/ARNt, su incorporación en el ribosoma, la preparación de muestras smFRET y la adquisición/análisis de datos19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET es sensible a las señales de fondo. Primero, es necesario recubrir la cámara de muestra con una interpolación al 0,05% y luego agregarse simultáneamente con la solución de ribosoma para bloquear la unión no específica del ribosoma a la superficie. Para ver la fluorescencia de la emisión de Cy5 aceptor, el cóctel eliminador de oxígeno (soluciones deoxy, glucosa y Trolox) es esencial. Sin esta solución, el blanqueo es demasiado rápido en el canal aceptor para obtener información útil. Otro paso crític…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01GM111452) y la Fundación Welch (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
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