リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究
Summary
単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。
Abstract
リボソームは、mRNAテンプレートに沿ってタンパク質をプロセス的に組み立てる大きなリボヌクレオタンパク質複合体です。リボソームの直径は、A-、P-およびEサイトで大きなtRNA基質を収容するために約20 nmである。その結果、リボソームダイナミクスは自然に素早く脱相します。単一分子法は、各リボソームを個別に検出し、不均質な集団を区別することができ、これは多成分系の複雑なメカニズムを明らかにするために不可欠である。ニコンTi2逆顕微鏡を用いたsmFRET法の詳細を報告し、リボソームタンパク質L27とtRNAの間のリボソームダイナミクスをプローブする。L27は独特なCys 53の位置でラベル付けされ、L27を欠くように設計されるリボソームに再構成される。tRNAは、その肘領域で標識される。tRNAが経え前および後転座などの伸び周期の間にリボソーム内の異なる場所に移動するにつれて、FRETの効率とダイナミクスは違いを示し、複数の亜集団が示唆されている。これらのサブ集団はアンサンブル法では検出できません。TIRFベースのsmFRET顕微鏡は、手動または電動反転顕微鏡、自家製レーザー照明で構築されています。リボソームサンプルは超遠心分離によって精製され、自家製のマルチチャンネルサンプルセルにロードされ、エバネッセントレーザーフィールドを介して照明されます。反射レーザースポットは、完璧な焦点のフィードバック制御を達成するために使用することができます。蛍光信号は、電動フィルタタレットで分離され、2台のデジタルCMOSカメラによって収集されます。強度は、NIS要素ソフトウェアを介して取得されます。
Introduction
リボソームは、大きい(50S)および小さい(30S)サブユニットのø 20 nm大きいリボヌクレオ蛋白質複合体である。mRNAテンプレートに沿って長いペプチドをプロセス的かつ協調的に組み立てます。リボソーム30SはfMet-tRNAfMetとmRNAに結合してタンパク質合成を開始し、50Sは結合して70S開始複合体を形成する。tRNAは、A部位(アミノアシル-tRNA結合部位)でリボソームにアミノ酸をもたらし、一方、細長いペプチジル鎖がP部位(ペプチジル-tRNA結合部位)に保持されている。転座前複合体では、ペプチジル鎖は1つのアミノ酸を加えてA部位のtRNAに移される。一方、P部位tRNAは脱アシル化される。次いで、A-, P-tRNAはP-, E-部位に移動して転座後複合体を形成し、このEサイトがtRNA出口部位を表す。この状態では、ペプチジル-tRNAはPサイトに戻ります。伸長サイクルは、前立体と後方構造の間で継続し、リボソームはmRNA上に転位し、一度に1コドン1個である。リボソームは、このプロセスを効率的かつ正確にするために、異なる機能部位を高度に調整しており、サブユニット間ラチェット2、tRNAハイブリダイゼーション変動3、GTPase活性化4、L1茎開閉5など。その結果、すべての分子が独自のペースで移動するため、リボソームはすぐに脱相します。従来の方法では、見かけ上の平均パラメータしか推定できませんが、人口の少ない種または短命の種は平均効果6でマスクされます。単一分子法は、各リボソームを個別に検出することによってこの制限を破ることができ、その後、統計的再構成7を介して異なる種を同定する。tRNA-tRNA 8、EF-G-L119、L1-tRNA10、等の相互作用のようなリボソームダイナミクスをプローブするために、異なる標識部位が実装されている。また、大小のサブユニットにそれぞれラベルを付けて、サブユニット間ラチェット運動と因子との協調が観察される11,12。一方、smFRET法は他の中心的な生物学的プロセスにおいて幅広い応用を有し、多色FRET法が13に出現している。
以前は新しいリボソームFRETペアが14,15で開発されました。組換えリボソームタンパク質L27は発現され、精製され、標識され、リボソームに戻って組み込まれている。このタンパク質は、近距離でtRNAと相互作用し、転座後複合体におけるP部位tRNAの安定化に役立った。tRNAがA-からPサイトに移動すると、このタンパク質とtRNAとの距離が短くなり、smFRETシグナルによって区別することができます。複数のリボソーム亜集団は、統計的方法および突然変異誘発を用いて同定されており、転座前の複合体におけるこれらの集団の自発的な交換は、リボソームがmRNA上で移動する前により柔軟であり、復号時にはより剛性であることを示唆している。これらのバリエーションは、リボソーム機能に不可欠です。ここで、プロトコルは、リボソーム/tRNA標識の詳細、リボソームにおけるそれらの組み込み、smFRETサンプル調製、およびデータ取得/分析19を記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET はバックグラウンド信号に敏感です。まず、サンプルチャンバを0.05%トゥイーンでコーティングし、リボソーム溶液と同時に添加して、表面へのリボソームの非特異的結合をブロックする必要があります。アクセプターCy5発光からの蛍光を見るためには、酸素スカベンジャーカクテル(デオキシ、グルコース、トロロークス溶液)が不可欠です。この解決策がなければ、アクセクサチャネ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(R01GM111452)とウェルチ財団(E-1721)によってサポートされています。
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
