단백질 티올 산화의 다중화 정량화를 위한 등압 탠덤 질량 태그 라벨링과 결합된 수지 보조 포획
Summary
단백질 티올 산화는 정상적인 생리적 및 병리생리학적 조건 하에서 중요한 의미를 갖는다. 자사는 수지 보조 포획, 등압 표지 및 질량분석법을 활용하여 단백질의 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 부위별 식별 및 정량화를 가능하게 하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 세부 사항을 설명합니다.
Abstract
단백질 티올에 대한 가역적 산화 변형은 최근 세포 기능의 중요한 매개체로 부상했습니다. 여기에서는 탠덤 질량 태그(TMT) 등압 라벨링 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)과 함께 수지 보조 포획(RAC)을 활용하여 프로테옴 수준에서 산화된 단백질 티올의 멀티플렉스 스토키오메트릭 정량화를 허용하는 정량적 산화 환원 단백질체학 방법의 자세한 절차를 설명합니다. 산화된 시스테인 잔기에 대한 부위별 정량적 정보는 이러한 변형의 기능적 영향에 대한 추가적인 통찰력을 제공합니다.
워크플로우는 배양된 세포(예: 포유류, 원핵생물) 및 전체 조직(예: 심장, 폐, 근육)을 포함한 많은 샘플 유형에 적용할 수 있으며, 이는 초기에 용해/균질화되고 인공 산화를 방지하기 위해 유리 티올이 알킬화됩니다. 산화된 단백질 티올은 티올 친화성 수지에 의해 환원 및 포획되며, 이는 단백질/펩타이드의 추가 전달 없이 진행된 소화, 라벨링 및 세척 절차를 수행할 수 있도록 하여 워크플로우 단계를 간소화하고 단순화합니다. 마지막으로, 표지된 펩타이드를 LC-MS/MS에 의해 용리 및 분석하여 전체 프로테옴에서 티올 산화와 관련된 포괄적인 화학량론적 변화를 나타냅니다. 이 방법은 단백질 티올 산화와 관련된 생리적 및 병리 생리 학적 상태 하에서 산화 환원 의존성 조절의 역할에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.
Introduction
항상성 조건에서 세포는 대사 및 신호 전달 1,2,3과 같은 과정을 촉진하는 데 도움이 되는 반응성 산소, 질소 또는 황 종을 생성하여 원핵생물과 진핵생물 모두로 확장됩니다. 이러한 반응성 종의 생리학적 수준은 ‘eustress’라고도 하는 적절한 세포 기능에 필요합니다.1,4. 대조적으로, 산화제와 항산화제 사이의 불균형으로 이어지는 산화제의 증가는 산화 스트레스 또는 ‘고통’1을 유발하여 세포 손상을 유발할 수 있습니다. 산화제는 단백질, DNA, RNA 및 지질을 포함한 다양한 생체 분자를 변형시켜 신호를 생물학적 경로로 변환합니다. 특히, 단백질의 시스테인 잔기는 시스테인 상의 티올기로 인해 산화되기 쉬운 반응성이 높은 부위이며, 이는 상이한 유형의산화제에 대해 반응성이다5. 이는 니트로실화(SNO), 글루타티오닐화(SSG), 술페닐화(SOH), 과황화(SSH), 다황화(SSNH),아실화 및 이황화물을 포함하여 시스테인에 대한 다양한 범위의 가역적 산화 환원 기반 번역 후 변형(PTM)을 발생시킵니다. 시스테인 산화의 비가역적 형태는 술피닐화 (SO2H) 및 술포닐화 (SO3H)를 포함한다.
시스테인 잔기의 가역적 산화 변형은 더 이상의 비가역적 산화를 방지하는 보호 역할을 하거나 하류 세포 경로6,7에 대한 신호 분자로서 작용할수 있다. 일부 티올 산화 환원 PTM의 가역성은 시스테인 부위가 “산화 환원 스위치”8,9로 기능할 수 있도록 하며, 여기서 이러한 부위의 산화 환원 상태의 변화는 일시적인 과정에서의 역할을 조절하기 위해 단백질 기능을 변경합니다. 산화 환원 PTMs(10)의 조절 효과는 촉매작용(12), 단백질-단백질 상호작용(13), 형태 변화(14), 금속 이온 배위(15) 또는 약리학적 억제제 결합(16)을 포함하는 단백질 기능(11)의 많은 측면에서 관찰되었다. 또한, 산화 환원 PTM은 전사17, 번역 18 또는 대사19와 같은 경로를 조절하는 단백질의 시스테인 부위에 관여합니다. 산화 환원 PTM이 단백질 기능 및 생물학적 과정에 미치는 영향을 감안할 때, 산화 환원 상태의 섭동에 반응하여 시스테인 부위가 겪는 산화 정도를 정량화하는 것이 중요합니다.
산화 환원 상태가 변경된 시스테인 부위의 식별은 정상 조건과 교란 조건 사이의 부위 별 수준에서 산화 상태를 비교하는 데 중점을 둡니다. 폴드 변화 측정은 사용자가 연구에서 생리학적으로 중요할 수 있는 시스테인 부위를 해석하는 데 도움이 되기 때문에 어떤 부위가 크게 변경되었는지 결정하는 데 자주 사용됩니다. 또는 특정 샘플 유형에 걸친 가역적 티올 산화의 화학량론적 측정은 세포 산화와 관련된 생리적 상태의 일반적인 그림을 제공하며, 이는 종종 간과되고 활용도가 낮은 중요한 측정입니다. 변형 화학량론은 변형된 티올의 백분율을 총 단백질 티올(변형 및 변형되지 않음)에 대한 비율로 정량화하는 것을 기반으로 합니다.20,21. 결과적으로 화학량론적 측정은 특히 질량분석법을 사용할 때 접힘 변화보다 더 정확한 측정을 제공합니다. 산화 증가의 중요성은 특정 시스테인 부위의 PTM 점유를 결정하기 위해 화학량론을 사용함으로써 보다 쉽게 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 티올 산화의 3 배 증가는 1 %에서 3 %로 또는 30 %에서 90 %로 큰 전이로 인해 발생할 수 있습니다. 3 % 점유 인 부위의 산화가 1 배 증가하면 단백질 기능에 거의 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나 휴식 상태에서 30 %의 점유율을 가진 사이트의 경우 3 배 증가가 더 크게 영향을받을 수 있습니다. 총 산화된 티올과 단백질 글루타티오닐화(SSG) 및 니트로실화(SNO)를 포함한 특정 산화 변형 간에 화학량론적 측정을 수행하면 특정 변형 유형에 대한 비율 및 정량적 정보를 나타낼 수 있습니다.
가역적 티올 산화는 전형적으로 낮은 존재비의 번역 후 변형이기 때문에, 생물학적 샘플로부터 이러한 변형을 포함하는 단백질의 농축을 위한 여러 접근법이 개발되었다. Jaffrey와 다른 사람들이 고안 한 초기 접근법 인 비오틴 스위치 기술 (BST) 22는 변형되지 않은 티올이 알킬화를 통해 차단되고, 가역적으로 변형 된 티올이 초기 유리 티올로 환원되고, 초기 유리 티올이 비오틴으로 표지되고, 표지 된 단백질이 스트렙 타비딘 친화성 풀다운에 의해 풍부 해지는 여러 단계를 포함합니다. 이 기술은 많은 연구에서 SNO와 SSG를 프로파일링하는 데 사용되었으며 다른 형태의 가역적 티올 산화23,24를 프로브하는 데 적용할 수 있습니다. BST는 다양한 형태의 가역적 티올 산화를 조사하는 데 활용되었지만,이 접근법의 한 가지 우려는 농축이 비 비오틴 화 단백질과 스트렙타비딘의 비특이적 결합에 의해 영향을 받는다는 것입니다. 우리 실험실에서 개발된 수지 보조 포획(RAC)25,26(그림 1)이라는 대체 접근법은 비오틴-스트렙타비딘 시스템을 통한 티올 그룹의 농축 문제를 우회합니다.
가역적으로 산화 된 티올의 환원에 이어, 초기 유리 티올을 갖는 단백질은 유리 티올 그룹을 공유 적으로 포획하는 티올 친화성 수지에 의해 농축되어 BST보다 시스테인 함유 단백질의보다 특이적인 농축을 가능하게한다. RAC를 최근 등압 라벨링 및 질량분석법의 발전의 멀티플렉싱 능력과 결합하면 프로테옴 전체 수준에서 가역적으로 산화된 시스테인 잔기의 농축, 식별 및 정량화를 위한 강력하고 민감한 워크플로우가 생성됩니다. 질량 분석법의 최근 발전은 티올 산화 환원 프로테옴의 훨씬 더 깊은 프로파일 링을 가능하게하여 단백질 티올 산화27의 원인과 결과에 대한 이해를 높입니다. 부위별 정량적 데이터로부터 얻은 정보는 가역적 산화 변형의 기계론적 영향 및 다운스트림 효과에 대한 추가 연구를 가능하게 한다28. 이 워크 플로우를 활용하면 노화와 같은 정상적인 생리적 사건과 관련하여 가역적 시스테인 산화의 생리적 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있으며, SSG 수준은 연령과 관련하여 다릅니다. SSG에 대한 노화 효과는 미토콘드리아 기능을 향상시키고 노화 마우스의 SSG 수준을 감소시키는 새로운 펩타이드 인 SS-31 (elamipretide)을 사용하여 부분적으로 역전되어 어린 마우스29와 더 유사한 SSG 프로파일을 갖게되었습니다.
나노 입자 노출로 인한 병태 생리 학적 조건은 마우스 대 식세포 모델에서 SSG를 포함하는 것으로 나타났습니다. 질량 분석법과 결합 된 RAC를 사용하여 저자들은 SSG 수준이 산화 스트레스 및 대 식세포 식세포 기능의 손상 정도와 직접적인 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. 데이터는 또한 서로 다른 정도의 산화 스트레스를 유발하는 서로 다른 조작 된 나노 물질에 대한 반응의 경로 별 차이를 밝혀 냈습니다30. 이 방법은 또한 원핵 생물 종에서 그 유용성을 입증했으며, 여기서 티올 산화와 관련하여 광합성 시아 노 박테리아에서 일주기의 영향을 연구하는 데 적용되었습니다. 전자 수송, 탄소 고정 및 해당 과정을 포함한 몇 가지 주요 생물학적 과정에서 티올 산화의 광범위한 변화가 관찰되었습니다. 또한, 직교 검증을 통해, 몇몇 주요 기능 부위가 변형되는 것으로 확인되었고, 이는 이러한 산화적 변형의 조절 역할을 시사한다6.
여기에서는 표준화된 워크플로우(그림 1)의 세부 사항을 설명하며, 단백질의 총 산화된 시스테인 티올의 농축과 후속 라벨링 및 화학량론적 정량화를 위한 RAC 접근법의 유용성을 보여줍니다. 이 워크플로우는 세포 배양27,30 및 전체 조직(예: 골격근, 심장, 폐)29,31,32,33을 포함한 다양한 샘플 유형의 산화 환원 상태 연구에서 구현되었습니다. 여기에 포함되지는 않았지만 RAC 프로토콜은 앞서 언급한25,29,34와 같이 SSG, SNO 및 S-아실화를 포함한 특정 형태의 가역적 산화 환원 변형의 조사에도 쉽게 적응할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수지 보조 포획은 시스테인 잔기25,29,30의 산화 변형을 조사하기 위해 다양한 샘플 유형 및 생물학적 시스템에 걸쳐 활용되었습니다. 이 방법을 사용하면 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 사용한 단백질 및 펩타이드뿐만 아니라 질량 분석법을 사용하는 개별 시스테인 부위를 포함한 여러 수준 및 판독 값에서 샘플을 평가할 수 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작업의 일부는 NIH 보조금 R01 DK122160, R01 HL139335 및 U24 DK112349의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
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