Summary

Улавливание с помощью смолы в сочетании с изобарической маркировкой тандемных масс-меток для мультиплексированной количественной оценки окисления тиола белка

Published: June 21, 2021
doi:

Summary

Окисление белка тиола имеет значительные последствия при нормальных физиологических и патофизиологических условиях. Мы описываем детали количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует захват с помощью смолы, изобарическую маркировку и масс-спектрометрию, что позволяет идентифицировать и количественно оценивать обратимо окисленные цистеиновые остатки белков.

Abstract

Обратимые окислительные модификации белковых тиолов недавно стали важными медиаторами клеточной функции. Здесь мы описываем подробную процедуру количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует смоляной захват (RAC) в сочетании с изобарической маркировкой тандемной массы (TMT) и жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), чтобы позволить мультиплексированную стохиометрическую количественную оценку окисленных белковых тиолов на уровне протеома. Количественная информация об окисленных остатках цистеина для конкретных участков дает дополнительное представление о функциональном воздействии таких модификаций.

Рабочий процесс адаптируется ко многим типам образцов, включая культивируемые клетки (например, млекопитающие, прокариоты) и целые ткани (например, сердце, легкие, мышцы), которые первоначально лизируются / гомогенизируются и со свободными тиолами, алкилированными для предотвращения искусственного окисления. Окисленные белковые тиолы затем восстанавливаются и захватываются тиол-аффинной смолой, которая оптимизирует и упрощает этапы рабочего процесса, позволяя выполнять процедуры переваривания, маркировки и промывки без дополнительной передачи белков / пептидов. Наконец, меченые пептиды элюируются и анализируются LC-MS / MS, чтобы выявить комплексные стехиометрические изменения, связанные с окислением тиола во всем протеоме. Этот метод значительно улучшает понимание роли окислительно-восстановительной регуляции при физиологических и патофизиологических состояниях, связанных с окислением белка тиола.

Introduction

В гомеостатических условиях клетки генерируют активный кислород, азот или серу, которые помогают облегчить процессы, такие как метаболизм и передача сигналов 1,2,3, распространяющихся как на прокариот, так и на эукариот. Физиологические уровни этих реактивных видов необходимы для правильной клеточной функции, также известной как «эустресс»1,4. Напротив, увеличение окислителей, которое приводит к дисбалансу между окислителями и антиоксидантами, может вызвать окислительный стресс или «дистресс»1, что приводит к повреждению клеток. Окислители передают сигналы биологическим путям, модифицируя различные биомолекулы, включая белок, ДНК, РНК и липиды. В частности, цистеиновые остатки белков представляют собой высокореакционноспособные участки, склонные к окислению из-за тиольной группы на цистеине, которая является реакционноспособной по отношению к различным типам окислителей5. Это приводит к появлению широкого спектра обратимых посттрансляционных модификаций на основе окислительно-восстановительных систем (ПТМ) для цистеина, включая нитрозилирование (SNO), глутатионилирование (SSG), сульфенилирование (SOH), персульфидирование (SSH), полисульфидирование (SSnH), ацилирование и дисульфиды. Необратимые формы окисления цистеина включают сульфинилирование (SO2H) и сульфонилирование (SO3H).

Обратимые окислительные модификации остатков цистеина могут выполнять защитные роли, предотвращающие дальнейшее необратимое окисление, или служить сигнальными молекулами для последующих клеточных путей 6,7. Обратимость некоторых окислительно-восстановительных ПТМ позволяет цистеиновым сайтам функционировать как «окислительно-восстановительные переключатели»8,9, при этом изменения в окислительно-восстановительном состоянии этих сайтов изменяют функцию белка для регулирования их роли в переходных процессах. Модулирующие эффекты окислительно-восстановительных ПТМ10 наблюдались во многих аспектах функциибелка 11, включая катализ12, белково-белковые взаимодействия13, изменение конформации14, координацию ионов металлов15 или фармакологическое связывание ингибитора16. Кроме того, окислительно-восстановительные ПТМ участвуют в цистеиновых сайтах белков, которые регулируют такие пути, как транскрипция17, трансляция18 или метаболизм19. Учитывая влияние, которое окислительно-восстановительные ПТМ оказывают на функцию белка и биологические процессы, важно количественно оценить степень окисления, которую подвергается сайт цистеина в ответ на возмущение окислительно-восстановительного состояния.

Идентификация цистеиновых участков с измененными окислительно-восстановительными состояниями сосредоточена на сравнении состояния окисления на сайт-специфическом уровне между нормальными и возмущенными условиями. Измерения изменения складок часто используются для определения того, какие участки значительно изменены, поскольку это помогает пользователям интерпретировать, какие участки цистеина могут быть физиологически значимыми для исследования. В качестве альтернативы, стехиометрические измерения обратимого окисления тиола в конкретном типе образца дают общую картину физиологического состояния в отношении клеточного окисления, что является важным измерением, которое часто упускается из виду и недостаточно используется. Модификационная стехиометрия основана на количественной оценке процента модифицированного тиола в соотношении к общему тиолу белка (модифицированному и немодифицированному)20,21. В результате стехиометрические измерения предлагают более точное измерение, чем изменение складки, особенно при использовании масс-спектрометрии. Значение увеличения окисления может быть более легко установлено с помощью стехиометрии для определения занятости PTM конкретного участка цистеина. Например, 3-кратное увеличение окисления тиола может быть результатом перехода всего на 1% к 3% или от 30% до 90%. 3-кратное увеличение окисления для участка, который заполняется только на 1%, может оказать незначительное влияние на функцию белка; тем не менее, 3-кратное увеличение для участка с 30% заполняемостью в состоянии покоя может быть более существенным. Стехиометрические измерения, выполняемые между общими окисленными тиолами и специфическими окислительными модификациями, включая глутатионилирование белка (SSG) и нитрозилирование (SNO), могут выявить соотношения и количественную информацию в отношении конкретных типов модификаций.

Поскольку обратимое окисление тиола обычно представляет собой посттрансляционную модификацию с низким содержанием, было разработано несколько подходов для обогащения белков, содержащих эти модификации, из биологических образцов. Ранний подход, разработанный Jaffrey и другими, названный методом переключения биотина (BST)22, включает в себя несколько этапов, на которых немодифицированные тиолы блокируются путем алкилирования, обратимо модифицированные тиолы восстанавливаются до зарождающихся свободных тиолов, зарождающиеся свободные тиолы мечуются биотином, а меченые белки обогащаются сцеплением сродства стрептавидина. Этот метод использовался для профилирования SNO и SSG во многих исследованиях и может быть адаптирован для зондирования других форм обратимого окисления тиола23,24. В то время как BST использовался для исследования различных форм обратимого окисления тиола, одна из проблем с этим подходом заключается в том, что на обогащение влияет неспецифическое связывание небиотинилированных белков со стрептавидином. Альтернативный подход, разработанный в нашей лаборатории, названный смоляным захватом (RAC)25,26 (Рисунок 1), обходит вопрос обогащения тиоловых групп с помощью системы биотин-стрептавидин.

После восстановления обратимо окисленных тиолов белки с зарождающимися свободными тиолами обогащаются тиол-аффинной смолой, которая ковалентно захватывает свободные тиольные группы, что позволяет более специфическо обогащать цистеинсодержащие белки, чем BST. Соединение RAC с мультиплексирующей способностью последних достижений изобарической маркировки и масс-спектрометрии создает надежный и чувствительный рабочий процесс для обогащения, идентификации и количественной оценки обратимо окисленных остатков цистеина на уровне протеома. Последние достижения в области масс-спектрометрии позволили гораздо глубже профилировать тиоловый окислительно-восстановительный протеом, повышая понимание как причины, так и следствия окисления белка тиола27. Информация, полученная на основе количественных данных по конкретным участкам, позволяет проводить дальнейшие исследования механистических воздействий и последующих эффектов обратимых окислительных модификаций28. Использование этого рабочего процесса дало представление о физиологических последствиях обратимого окисления цистеина в отношении нормальных физиологических событий, таких как старение, при этом уровни SSG различались в зависимости от возраста. Эффекты старения на SSG были частично обращены вспять с помощью SS-31 (эламипретид), нового пептида, который усиливает митохондриальную функцию и снижает уровень SSG у пожилых мышей, в результате чего у них профиль SSG, более похожий на молодых мышей29.

Было показано, что патофизиологические условия, связанные с воздействием наночастиц, включают SSG в модель макрофагов мыши. Используя RAC в сочетании с масс-спектрометрией, авторы показали, что уровни SSG напрямую коррелируют со степенью окислительного стресса и нарушения фагоцитарной функции макрофагов. Данные также выявили специфические для пути различия в реакции на различные инженерные наноматериалы, которые вызывают различные степени окислительного стресса30. Метод также доказал свою полезность при прокариотических видах, где он применялся для изучения влияния суточных циклов на фотосинтетические цианобактерии в отношении окисления тиола. Наблюдались широкие изменения в окислении тиола в нескольких ключевых биологических процессах, включая перенос электронов, фиксацию углерода и гликолиз. Кроме того, с помощью ортогональной валидации было подтверждено, что несколько ключевых функциональных участков были модифицированы, что свидетельствует о регуляторной роли этих окислительных модификаций6.

Здесь мы описываем детали стандартизированного рабочего процесса (рисунок 1), демонстрируя полезность подхода RAC для обогащения общих окисленных цистеиновых тиолов белков и их последующей маркировки и стехиометрической количественной оценки. Этот рабочий процесс был реализован в исследованиях окислительно-восстановительного состояния в различных типах образцов, включая клеточные культуры27,30 и целые ткани (например, скелетные мышцы, сердце, легкие)29,31,32,33. Хотя протокол RAC не включен здесь, он также легко адаптируется для исследования конкретных форм обратимых окислительно-восстановительных модификаций, включая SSG, SNO и S-ацилирование, как упоминалось ранее 25,29,34.

Protocol

Все процедуры, описанные в протоколе, связанные с образцами/тканями животных или человека, были одобрены и соответствовали институциональным руководящим принципам Комитета по этике исследований человека и животных. 1. Гомогенизация/лизис образцов Замороженные об?…

Representative Results

Завершение протокола приведет к высокоспецифичному обогащению ранее окисленных цистеинсодержащих пептидов, часто со специфичностью >95% 27,35,36. Однако несколько ключевых этапов протокола требуют особого внимания, например, первоначаль…

Discussion

Улавливание с помощью смолы использовалось в различных типах образцов и биологических системах для исследования окислительных модификаций остатков цистеина 25,29,30. Этот метод позволяет оценивать образцы на нескольких уровнях и показ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Часть работы была поддержана грантами NIH R01 DK122160, R01 HL139335 и U24 DK112349

Materials

2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride Med Chem Express HY-101794 Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 30108310
5.0 mL round bottom tubes Falcon 352054
Acetone Fisher Scientific A949-1
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Activated Thiol–Sepharose 4B Sigma Aldrich T8512 Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter Millipore Sigma UFC5010BK
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830
Bicinchonicic acid (BCA) Thermo Scientific 23227 Protein Assay Reagent
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5415R
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific 20291
EDTA Sigma Aldrich E5134
HEPES buffer Sigma Aldrich H4034
Homogenizer BioSpec Products 985370
Iodoacetimide (IAA) Sigma Aldrich I1149
N-ethylmaleimide Sigma Aldrich 4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow Cytiva 17-0906-01 Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L6026
Sonicator Branson 1510R-MT
Spin columns Thermo Scientific 69705
Strata C18-E reverse phase columns Phenomenex 8B-S001-DAK Peptide desalting
Thermomixer Eppendorf 5355
Thiopropyl Sepharose 6B GE Healthcare 17-0420-01 Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex) Thermo Scientific A44522 Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) Sigma Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich T6508
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Trypsin Promega V5820
Urea Sigma Aldrich U5378
Vacufuge Plus speedvac Eppendorf 22820001 vacuum concentrator
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236

References

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -. P., Dietz, K. -. J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
  19. Gao, X. -. H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -. F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Play Video

Cite This Article
Gaffrey, M. J., Day, N. J., Li, X., Qian, W. Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation. J. Vis. Exp. (172), e62671, doi:10.3791/62671 (2021).

View Video