التنميط المتعدد بدون صانعي التدرج أو أنظمة التجزئة
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء ملف تعريف متعدد الأبعاد دون استخدام صانعي التدرج الآلي أو أنظمة تجزئة التدرج.
Abstract
يعد تجزئة الترسبات المتعددة بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز أداة قوية يمكن استخدامها لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم ، وتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المحدد الذي يتم ترجمته بواسطة الريبوسومات ، وتحليل العوامل المرتبطة بالمتعددات. في حين أن صانعي التدرج الآلي وأنظمة تجزئة التدرج تستخدم عادة مع هذه التقنية ، فإن هذه الأنظمة باهظة الثمن بشكل عام ويمكن أن تكون باهظة التكلفة للمختبرات التي لديها موارد محدودة أو لا يمكنها تبرير النفقات بسبب حاجتها النادرة أو العرضية لأداء هذه الطريقة لأبحاثها. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد ملفات تعريف متعددة الوسائط بشكل متكرر باستخدام المعدات القياسية المتوفرة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية دون أدوات تجزئة متخصصة. علاوة على ذلك ، يتم توفير مقارنة بين الملامح المتعددة التي تم إنشاؤها مع وبدون نظام تجزئة التدرج. تتم مناقشة استراتيجيات لتحسين وإنتاج ملفات تعريف متعددة قابلة للتكرار. يستخدم Saccharomyces cerevisiae ككائن حي نموذجي في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول وتكييفه بسهولة لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم للعديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا المختلفة.
Introduction
الريبوسومات هي مجمعات البروتين النووي الريبي الضخمة دالتون التي تؤدي العملية الأساسية لترجمة الحمض النووي الريبي المرسال إلى بروتينات. الريبوسومات هي المسؤولة عن تنفيذ تخليق جميع البروتينات داخل الخلية. تتكون الريبوسومات حقيقية النواة من وحدتين فرعيتين معينتين باسم الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة (40S) والوحدة الفرعية الريبوسومية الكبيرة (60S) وفقا لمعاملات الترسيب الخاصة بها. تم تعيين الريبوسوم المجمع بالكامل على أنه أحادي 80S. Polysomes هي مجموعات من الريبوسومات التي تعمل في ترجمة جزيء mRNA واحد. تجزئة الجزيئات المتعددة بواسطة الطرد المركزي المتدرج بكثافة السكروز هي طريقة قوية تستخدم لإنشاء ملفات تعريف الريبوسوم ، وتحديد الحمض النووي الريبوزي المرسال المحدد المرتبط بترجمة الريبوسومات وتحليل العوامل المرتبطة بالمتعددات1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 ، 13. غالبا ما تستخدم هذه التقنية لفصل البوليسومات عن الريبوسومات المفردة والوحدات الفرعية الريبوسومية وجزيئات البروتين النووي الريبي الرسول. يمكن أن توفر الملامح التي تم الحصول عليها من التجزئة معلومات قيمة فيما يتعلق بنشاط ترجمة البوليسومات14 وحالة تجميع الريبوسومات15،16،17.
تجميع الريبوسوم هو عملية معقدة للغاية تسهيلها مجموعة من البروتينات المعروفة باسم عوامل تجميع الريبوسوم18،19،20،21. تؤدي هذه العوامل مجموعة واسعة من الوظائف أثناء التكوين الحيوي للريبوسوم من خلال التفاعلات مع العديد من البروتينات الأخرى ، بما في ذلك ATPases و endo- و exo-nucleases و GTPases و RNA helicases و RNA binding proteins22. كان تجزئة التريبوسوم أداة قوية تستخدم للتحقيق في دور هذه العوامل في تجميع الريبوسوم. على سبيل المثال ، تم استخدام هذه الطريقة لتوضيح كيف يمكن للطفرات في كيناز متعدد النوكليوتيدات Grc3 ، وهو عامل معالجة ما قبل rRNA ، أن يؤثر سلبا على عملية تجميع الريبوسوم17,23. كما سلط التنميط المتعدد الضوء على كيفية كون الزخارف المحفوظة داخل ATPase Rix7 ضرورية لإنتاج الريبوسوم16 وبينها.
يبدأ إجراء تجزئة البولسوم بصنع محللات الخلايا القابلة للذوبان من الخلايا ذات الاهتمام. يحتوي الليزات على الحمض النووي الريبي ، والوحدات الفرعية الريبوسومية ، والبوليسومات ، بالإضافة إلى مكونات خلوية أخرى قابلة للذوبان. يتم إجراء تدرج مستمر وخطي من السكروز داخل أنبوب جهاز طرد مركزي فائق. يتم تحميل الجزء القابل للذوبان من تحلل الخلايا بلطف على الجزء العلوي من أنبوب تدرج السكروز. ثم يخضع أنبوب التدرج المحمل للطرد المركزي ، والذي يفصل المكونات الخلوية حسب الحجم داخل تدرج السكروز بقوة الجاذبية. تنتقل المكونات الأكبر حجما إلى التدرج أكثر من المكونات الأصغر. يضم الجزء العلوي من التدرج المكونات الخلوية الأصغر والأبطأ ، في حين توجد المكونات الخلوية الأكبر والأسرع في الأسفل. بعد الطرد المركزي ، يتم جمع محتويات الأنبوب ككسور. تفصل هذه الطريقة بشكل فعال الوحدات الفرعية الريبوسومية والأحادية والبوليسومات. ثم يتم تحديد الكثافة البصرية لكل جزء عن طريق قياس الامتصاص الطيفي عند طول موجي يبلغ 254 نانومتر. رسم الامتصاص مقابل عدد الكسر ينتج عنه ملف تعريف متعدد الشكل.
يمكن إنشاء تدرجات كثافة السكروز الخطية باستخدام صانع التدرج. بعد الطرد المركزي ، غالبا ما يتم تجزئة التدرجات ، ويتم قياس الامتصاص باستخدام نظام تجزئة الكثافة الآلي3،7،13،24،25. في حين أن هذه الأنظمة تعمل بشكل جيد للغاية لإنتاج ملفات تعريف متعددة ، إلا أنها باهظة الثمن ويمكن أن تكون باهظة التكلفة لبعض المختبرات. هنا يتم تقديم بروتوكول لإنشاء ملفات تعريف متعددة دون استخدام هذه الأدوات. بدلا من ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول المعدات المتوفرة عادة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا تم وصف طريقة لإنشاء ملفات تعريف متعددة دون استخدام أنظمة تجزئة آلية باهظة الثمن. ميزة هذه الطريقة هي أنها تجعل التنميط متعدد الوسائط في متناول المختبرات التي ليس لديها أنظمة تجزئة آلية. العيوب الرئيسية لهذا البروتوكول هي تجزئة اليد المملة وانخفاض الحساسية مقارنة بنظام تجزئة الكثافة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان الدكتور بيرسي تومبالي والدكتورة ميليسا ويلز على قراءتهما النقدية لهذه المخطوطة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني الأمريكي للبحوث الصحية الداخلية؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (NIEHS; ZIA ES103247 إلى R.E.S).
Materials
| Automatic Fractionator | Brandel | ||
| Clariostar Multimode Plate Reader | BMG Labtech | ||
| Cycloheximide | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Glass Beads, acid washed | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnesium Chloride, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| Needle, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | custom length 9 inches, point style 3 |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polypropylene Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polypropylene Test Tube Peg Rack | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Syringe, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Microplate, 96 wells | Greiner Bio-One | 655801 |
References
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 2106, 299-310 (2020).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- Liang, S., et al. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46 (1), 3 (2018).
- Karamysheva, Z. N., et al. Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600 (2018).
- Jin, H. Y., Xiao, C. An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation. Bio-protocol. 7 (19), 2573 (2017).
- Kudla, M., Karginov, F. V. Measuring mRNA translation by polysome profiling. Methods in Molecular Biology. 1421, 127-135 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295 (2014).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164 (2014).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles. Bio-protocol. 7 (3), 2126 (2017).
- Chikashige, Y., et al. Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs. Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).
- Ingolia, N. T. Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome. Cell. 165 (1), 22-33 (2016).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).
- Lo, Y. H., et al. Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7. Nature Communications. 10 (1), 513 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Klinge, S., Woolford, J. L. Ribosome assembly coming into focus. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).
- Bassler, J., Hurt, E. Eukaryotic ribosome assembly. Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).
- Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis. Biomolecules. 9 (11), 715 (2019).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Hu, W., Coller, J. Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A., et al. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
