无需梯度测定器或分馏系统的多聚体分析

Summary

该协议描述了如何在不使用自动梯度制作器或梯度分级分离系统的情况下生成多聚体谱。

Abstract

通过蔗糖密度梯度离心进行多聚体分级分离是一种强大的工具，可用于创建核糖体谱，鉴定核糖体翻译的特定mRNA，并分析多聚体相关因子。虽然自动梯度测定器和梯度分馏系统通常与这种技术一起使用，但这些系统通常价格昂贵，并且对于资源有限或由于不经常或偶尔需要执行此方法而无法证明费用合理的实验室来说成本过高。在这里，提出了一种协议，使用大多数分子生物学实验室中可用的标准设备（无需专门的分级分离仪器）可重复地生成多聚体谱。此外，还提供了使用和不使用梯度分馏系统生成的多聚体谱图的比较。讨论了优化和产生可重复的多体谱的策略。 酿酒酵母 在本协议中用作模式生物。然而，该协议可以很容易地修改和调整，以产生许多不同的生物体和细胞类型的核糖体谱。

Introduction

核糖体是巨型道尔顿核糖核蛋白复合物，执行将mRNA翻译成蛋白质的基本过程。核糖体负责进行细胞内所有蛋白质的合成。真核核糖体包括两个亚基，根据其沉降系数指定为小核糖体亚基（40S）和大核糖体亚基（60S）。完全组装的核糖体被指定为80S单体。多聚体是参与翻译单个mRNA分子的核糖体组。通过蔗糖密度梯度离心分馏多聚体是一种强大的方法，用于创建核糖体谱，鉴定与翻译核糖体相关的特定mRNA，并分析多聚体相关因子¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9，10，^11，12，13.该技术通常用于从单个核糖体、核糖体亚基和信使核糖核蛋白颗粒中分离多聚体。从分级分离中获得的图谱可以提供有关多聚体14的翻译活性和核糖体^15，16，¹⁷的组装状态的宝贵信息。

核糖体组装是一个非常复杂的过程，由一组称为核糖体组装因子¹⁸，^19，20，21的蛋白质促进。这些因子通过与许多其他蛋白质（包括ATP酶，内切和外切核酸酶，GTP酶，RNA解旋酶和RNA结合蛋白）的相互作用，在核糖体生物发生过程中执行广泛的功能²²。多聚体分级分离一直是用于研究这些因素在核糖体组装中的作用的有力工具。例如，该方法已被用于证明多核苷酸激酶Grc3（一种前rRNA加工因子）的突变如何对核糖体组装过程产生负面影响^17，23。多聚体分析还强调并展示了ATPase Rix7中的保守基序对核糖体生产至关重要¹⁶。

多聚体分级分离的过程始于从感兴趣的细胞中制备可溶性细胞裂解物。裂解物含有RNA、核糖体亚基和多聚体，以及其他可溶性细胞成分。在超速离心管内进行连续的线性蔗糖梯度。将细胞裂解物的可溶性部分轻轻上样到蔗糖梯度管的顶部。然后对装载的梯度管进行离心，离心通过重力在蔗糖梯度内按大小分离细胞成分。较大的分量比较小的分量更深入梯度。梯度的顶部容纳较小，移动较慢的细胞成分，而较大，快速移动的细胞成分位于底部。离心后，将管中的内容物收集为馏分。该方法可有效分离核糖体亚基、单体和多聚体。然后通过测量254nm波长处的光谱吸光度来确定每个级分的光密度。绘制吸光度与分数数的关系图可生成多聚体谱图。

可以使用梯度制作器生成线性蔗糖密度梯度。离心后，通常对梯度进行分馏，并使用自动密度分馏系统³，^7，13，^24，25测量吸光度。虽然这些系统在生产多聚体谱方面效果很好，但它们价格昂贵，并且对一些实验室来说成本过高。这里提出了一种在不使用这些仪器的情况下生成多聚体谱的协议。相反，该协议利用大多数分子生物学实验室中通常可用的设备。

Protocol

1. 制备7%-47%蔗糖梯度 注意：蔗糖梯度的线性范围可以根据所使用的细胞类型进行修改，以实现更好的分离。该协议针对 酿酒酵母的多体谱进行了优化。 在蔗糖梯度缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl2 和 1 mM DTT）中制备 7% 和 47% 蔗糖储备溶液。过滤器通过0.22μm过滤器对蔗糖储备溶液进行灭菌，并储存在4°C。 通过按 表1中所?…

Representative Results

图3显示了三个代表性的多聚体谱。所有配置文件都来自相同的酵母菌株。典型的多体谱将具有40S，60S和80S核糖体亚基以及多聚体的良好分离峰。每个核糖体亚基和多聚体峰的嵴在每个轮廓上都很明显（图3）。自动密度分馏系统的代表性曲线如图3A所示。用于生成该轮廓的蔗糖梯度是按照本协议中所述手动制备的。…

Discussion

这里描述了一种无需使用昂贵的自动分馏系统即可创建多聚体谱的方法。这种方法的优点是，它使没有自动分级分离系统的实验室可以使用多聚体分析。与专用密度分级分离系统相比，该方案的主要缺点是繁琐的手工分馏和灵敏度降低。

该方案需要仔细制备蔗糖梯度，其分辨率足以分离核糖体亚基，单体和多聚体。在制备蔗糖梯度时，在加载梯度层时不要引入气泡至关重要?…

Materials

Automatic Fractionator	Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Glass Beads, acid washed	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Magnesium Chloride, 1 M	KD Medical	CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub	Hamilton Company	7748-08	custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack	Fisher Scientific	14-810-54A
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNAse Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg	Beckman Coulter	331336
Syringe, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 wells	Greiner Bio-One	655801