مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda
Summary
تم تحقيق التحول الجرثومي الناجح في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda، باستخدام مرنا من نقل piggyBac مفرط النشاط.
Abstract
إن الإدراج المستقر للشحن الجيني في جينوم الحشرات باستخدام عناصر قابلة للانتقال هو أداة قوية للدراسات الجينومية الوظيفية ووضع استراتيجيات إدارة الآفات الوراثية. العنصر الأكثر استخداما القابلة للتحويل في تحول الحشرات هو piggyBac، وقد تم إجراء تحويل الجرثومة المستندة إلى piggyBacبنجاح في الحشرات النموذجية. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب استخدام هذه التكنولوجيا في الحشرات غير النموذجية التي تشمل الآفات الزراعية. هذه الورقة تقارير عن التحول الجرثومي من الآفات الزراعية العالمية، ودودة الجيش الخريف (FAW)، Spodoptera frugiperda،وذلك باستخدام نقل piggyBac مفرط النشاط (hyPBase).
في هذا العمل، تم إنتاج الحمض النووي الريبي hyPBase واستخدامه بدلا من البلازميد المساعد في عمليات التجريب الدقيق للجنين. وأدى هذا التغيير إلى نجاح جيل من FAW المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب فحص الحيوانات المعدلة وراثيا، والكشف السريع القائم على PCR من إدخال المتحولين جنسيا، وتحديد موقع التكامل القائم على PCR المتشابكة الحرارية (TAIL-PCR). وهكذا، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج FAW المعدلة وراثيا، والتي سوف تسهل نقل النسل piggyBacالقائم في FAW وغيرها من الحشرات lepidopteran.
Introduction
دودة الجيش الخريف (FAW), Spodoptera frugiperda, هو الأصلي إلى المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية في أمريكا. حاليا ، هذا هو عشب الحشرات المدمرة في أكثر من 100 دولة في جميع أنحاء العالم1. تتغذى يرقات FAW على أكثر من 350 مصنعا مضيفا ، بما في ذلك بعض المحاصيل الغذائية الأساسية الهامة2. قدرة الهجرة القوية للبالغين FAW يساهم في انتشاره السريع مؤخرا من الأمريكتين إلى أماكن أخرى1،2. ونتيجة لذلك ، تهدد هذه الحشرة الآن الأمن الغذائي على الصعيد الدولي. وقد ييسر تطبيق التكنولوجيات الجديدة إجراء دراسات متقدمة في FAW ويوفر استراتيجيات جديدة لإدارة هذه الآفة.
وقد استخدم التحول الجرثومي الحشري لدراسة وظيفة الجينات وتوليد الحشرات المعدلة وراثيا لاستخدامها في السيطرة الوراثية3،4. من بين الطرق المختلفة المستخدمة لتحقيق التحول الجيني في الحشرات ، فإن الطريقة المستندة إلى عنصر piggyBac هي الطريقة الأكثر استخداما5. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض معدل النقل ، لا يزال من الصعب إجراء تولد في الحشرات غير النموذجية. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نسخة مفرطة النشاط من نقل piggyBac (hyPBase)6،7. تم تحقيق التحول Germline في FAW مؤخرا8، وهو أول تقرير يستخدم hyPBase في الحشرات lepidopteran. في هذا التقرير، يتم وصف معلومات مفصلة عن استخدام الحمض النووي الريبي hyPBase في توليد FAW المعدلة وراثيا. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا لتحقيق تحول الحشرات lepidopteran الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحد المعدل المنخفض للتحويل وصعوبة توصيل المكونات المعدلة وراثيا إلى أجنة جديدة من نجاح التحول الجرثومي في العديد من الحشرات غير النموذجية ، وخاصة تلك الموجودة من أجل ، Lepidoptera. لزيادة معدل التحول الجرثومي، تم تطوير نسخة مفرطة النشاط من نقل piggyBac الأكثر استخداما (hyPBase)7،</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم البحث المبلغ عنه المؤسسة الوطنية للعلوم I/UCRC، مركز تقنيات إدارة المفصليات، تحت المنحة رقم IIP-1821936 ومن قبل شركاء الصناعة، منحة تنافسية لمبادرة الزراعة والبحوث الغذائية رقم 2019-67013-29351 والمعهد الوطني للأغذية والزراعة، وزارة الزراعة الأمريكية (2019-67013-29351 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
