Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda
Summary
La trasformazione germinale di successo nel verme dell’esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l’mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.
Abstract
L’inserimento stabile di carichi genetici nei genomi degli insetti utilizzando elementi trasponibili è un potente strumento per studi genomici funzionali e lo sviluppo di strategie genetiche di gestione dei parassiti. L’elemento trasponibile più utilizzato nella trasformazione degli insetti è piggyBace la trasformazione germinale a base di piggyBacè stata condotta con successo negli insetti modello. Tuttavia, è ancora difficile impiegare questa tecnologia in insetti non modello che includono parassiti agricoli. Questo documento riporta la trasformazione germinale di un parassita agricolo globale, il verme dell’esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, utilizzando la trasposasi iperattiva piggyBac (hyPBase).
In questo lavoro, l’mRNA hyPBase è stato prodotto e utilizzato al posto del plasmide helper nelle microiniezioni embrionali. Questo cambiamento ha portato alla generazione di successo di FAW transgenico. Inoltre, vengono descritti anche i metodi di screening degli animali transgenici, il rilevamento rapido basato sulla PCR dell’inserimento transgenico e la determinazione termica asimmetrica interlacciata della PCR (TAIL-PCR) del sito di integrazione. Pertanto, questo documento presenta un protocollo per produrre FAW transgenico, che faciliterà la transgenesi basata su piggyBacin FAW e altri insetti lepidotteri.
Introduction
Il verme dell’esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, è originario delle regioni tropicali e subtropicali dell’America. Attualmente, questo è un erbivoro insetto devastante in più di 100 paesi in tutto il mondo1. Le larve faw si nutrono di oltre 350 piante ospiti, tra cui alcune importanti colture alimentari di base2. La forte capacità migratoria degli adulti FAW contribuisce alla sua recente rapida diffusione dalle Americhe ad altri luoghi1,2. Di conseguenza, questo insetto sta ora minacciando la sicurezza alimentare a livello internazionale. L’applicazione di nuove tecnologie può facilitare studi avanzati in FAW e fornire nuove strategie per gestire questo parassita.
La trasformazione germinale degli insetti è stata utilizzata per studiare la funzione genica e generare insetti transgenici da utilizzare nel controllogenetico3,4. Tra i vari metodi utilizzati per ottenere la trasformazione genetica negli insetti, il metodo basato sugli elementi piggyBac è il metodo più utilizzato5. Tuttavia, a causa del basso tasso di trasposizione, è ancora difficile condurre la transgenesi in insetti non modello. Recentemente, una versione iperattiva di piggyBac transposase (hyPBase) è stata sviluppata6,7. La trasformazione germinale è stata raggiunta in FAW recentemente8, che è il primo rapporto che ha utilizzato l’hyPBase negli insetti lepidotteri. In questo rapporto vengono descritte informazioni dettagliate sull’utilizzo di mRNA hyPBase nella generazione di FAW transgenica. Il metodo qui descritto potrebbe essere applicato per ottenere la trasformazione di altri insetti lepidotteri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il basso tasso di trasposizione e la difficoltà di fornire componenti transgenici in embrioni freschi limitano il successo della trasformazione germinale in molti insetti non modello, specialmente quelli di ordine, Lepidotteri. Per aumentare il tasso di trasformazione della linea germinale, è stata sviluppata una versione iperattiva della trasposasi piggyBac più utilizzata (hyPBase)7,10. Ad oggi, la trasformazione germinale di successo negli insetti l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata è supportata dalla National Science Foundation I / UCRC, dal Center for Arthropod Management Technologies, sotto Grant No IIP-1821936 e da partner industriali, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 e 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
