Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vävnadsuppsamling och RNA-extraktion från den mänskliga osteoarthritiska knäleden

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Primära vävnader som erhållits från patienter efter total knä artroplastik ger en experimentell modell för artros forskning med maximal klinisk översättningsbarhet. Detta protokoll beskriver hur man identifierar, bearbetar och isolerar RNA från sju unika knä vävnader för att stödja mekanistisk undersökning i mänskliga artros.

Abstract

Artros (OA) är en kronisk och degenerativ ledsjukdom som oftast påverkar knäet. Eftersom det för närvarande inte finns något botemedel är total knä artroplastik (TKA) ett vanligt kirurgiskt ingrepp. Experiment med primära mänskliga OA vävnader som erhållits från TKA ger förmågan att undersöka sjukdomsmekanismer ex vivo. Medan OA tidigare troddes påverka främst brosk, är det nu känt att påverka flera vävnader i leden. Detta protokoll beskriver patientens urval, prov bearbetning, vävnad homogenisering, RNA extraktion och kvalitetskontroll (baserat på RNA renhet, integritet och avkastning) från var och en av sju unika vävnader för att stödja sjukdom mekanism undersökning i knä leden. Med informerat samtycke erhölls prover från patienter som genomgår TKA för OA. Vävnader dissekerades, tvättades och lagrades inom 4 h av kirurgi genom flash frysning för RNA eller formalin fixering för histologi. Insamlade vävnader ingår articular brosk, subchondral ben, menisk, infrapatellar fett pad, främre korsband, synovium och vastus medialis sneda muskeln. RNA extraktionsprotokoll testades för varje vävnadstyp. Den viktigaste modifieringen involverade metoden för sönderfall som används för lågcelliga, högmatris, hårda vävnader (betraktas som brosk, ben och menisk) jämfört med relativt högcelliga, lågmatris, mjuka vävnader (betraktas som fettkudde, ligament, synovium och muskel). det konstaterades att pulverisering var lämplig för hårda vävnader, och homogenisering var lämplig för mjuka vävnader. En proclivity för vissa försökspersoner att ge högre RNA integritet tal (RIN) värden än andra ämnen konsekvent över flera vävnader observerades, vilket tyder på att underliggande faktorer såsom sjukdomens svårighetsgrad kan påverka RNA kvalitet. Förmågan att isolera högkvalitativt RNA från primära mänskliga OA-vävnader ger en fysiologiskt relevant modell för sofistikerade genuttrycksexperiment, inklusive sekvensering, som kan leda till kliniska insikter som lättare översätts till patienter.

Introduction

Knäet är den största synoviala leden i människokroppen, bestående av den tibiofemorala leden mellan skenbenet och lårbenet och patellofemoralleden mellan patella och lårbenet1. Benen i knäet är fodrade med ledbrosk och stöds av olika bindväv, inklusive menisci, fett, ligament och muskler, och ett synovialmembran kapslar in hela leden för att skapa en synovial vätskefylld hålighet1,2,3 ( figur1). Ett friskt knä fungerar som en mobil gångjärnsled som möjliggör friktionsfri rörelse i frontplanet1,3. Under patologiska förhållanden kan rörelse bli begränsad och smärtsam. Den vanligaste degenerativa knäledssjukdomen är artros (OA)4. En mängd olika riskfaktorer är kända för att predisponera för OA-utveckling, inklusive äldre ålder, fetma, kvinnligt kön, ledtrauma och genetik, bland annat5,6. Det finns för närvarande uppskattningsvis 14 miljoner människor i USA med symtomatiskt knä OA, med prevalensen ökar på grund av stigande befolkningsålder och fetma7,8. Ursprungligen anses vara en sjukdom i brosket, OA förstås nu som en sjukdom i hela leden9. Vanliga patologiska förändringar i OA inkluderar ledbroskerosion, osteofytbildning, subkondral benförtjockning och inflammation i synovium9,10. Eftersom det inte finns något känt botemedel mot OA, fokuserar behandlingarna främst på symtom (t.ex. smärta) hantering11,12, och när OA har utvecklats till slutstadiet, är ledproteskirurgi ofta indicerat13.

Gemensamma ersätter operationer kan antingen vara partiella eller totala knä ersätter, med totala knä artroplastik (TKA) inklusive ersätta hela tibiofemoral artikulering och patellofemoral gemensamma. Från och med 2020 utförs cirka 1 miljon TKA i USA varje år14. Under TKA resects en ortopedisk kirurg den övre delen av tibialplatån och de nedre femorala kondyler (figur 2A, 2B) som ska förses med protesimplantat. Ibland feltolkas av patienter, i en TKA, endast 8-10 mm återförsluts från slutet av varje ben, som därefter är täckt eller ytbehandlas, med metall. Ett interposed polyetenfoder bildar lagerytan (dvs. stoppning) mellan de två metallimplantaten. Dessutom är flera mjukvävnadskomponenter i leden helt eller delvis strukna för att uppnå korrekt ledbalans. Bland dessa vävnader finns mediala och laterala menisci (figur 2C), infrapatellar fett pad (figur 2D), främre korsband (ACL; Figur 2E), synovium (figur 2F)och vastus medialis sned muskel (VMO; Bild 2G) 15. Även om TKA i allmänhet är framgångsrika för OA-behandling, rapporterar cirka 20% av patienterna återkommande smärta efter operationen16. Tillsammans med den höga kostnaden och den relativa invasiviteten i förfarandet pekar dessa begränsningar på behovet av ytterligare forskning för att identifiera alternativa behandlingar för att mildra utvecklingen av OA.

För att utforska sjukdomsmekanismer i OA som kan presentera nya vägar för terapeutisk intervention, experimentella system, inklusive celler, vävnad explanter och djurmodeller kan användas. Celler odlas vanligtvis i monolager och härrör från primära vävnader från människor eller djur (t.ex. kondrocyter isolerade från brosk) eller odödliga celler (t.ex. ATDC517 och CHON-00118). Medan celler kan vara användbara för att manipulera experimentella variabler i en kontrollerad kulturmiljö, fångar de inte förhållanden i den naturliga leden som är kända för att påverka cellfenotyper19. För att bättre rekapitulera den komplexa kaskaden av kemisk, mekanisk och cell-till-cell-kommunikation som ligger till grund för OA, finns ett alternativ i primära vävnadsprover från människor eller djur, oavsett om de används färska eller odlade ex vivo som explanter, för att bevara vävnadsstrukturen och cellmikromiljön20. För att studera leden in vivoär små (t.ex. mus21)och stora (t.ex. häst22)djurmodeller för OA (t.ex. genom kirurgisk induktion, genetisk förändring eller åldrande) också användbara. Översättning från dessa modeller till mänsklig sjukdom kan dock begränsas av anatomiska, fysiologiska och metaboliska skillnader, bland annat23. Med tanke på fördelarna och nackdelarna med experimentella system maximerar de viktigaste styrkorna med att vara artspecifik och upprätthålla den extracellulära nisch som erbjuds av de primära mänskliga OA-vävnaderna den translationella potentialen hos forskningsresultat.

Primära mänskliga OA vävnader kan lätt erhållas efter TKA, vilket gör den höga frekvensen av TKAs en värdefull resurs för forskning. Bland potentiella experimentella tillämpningar finns genuttryck och histologiska analyser. För att förverkliga potentialen hos primära mänskliga OA vävnader för dessa forskningsmetoder och andra, beskrivs följande viktiga överväganden. För det första är användningen av patientprover föremål för etisk reglering, och protokollen måste uppfylla IRB-godkännanden (Institutional Review Board)24. För det andra skapar den inneboende heterogeniteten hos mänskliga primära sjuka vävnader och påverkan av variabler som ålder och kön, bland annat, behovet av noggrant patientval (dvs. tillämpning av behörighetskriterier) och datatolkning. För det tredje kan de unika biologiska egenskaperna hos olika vävnader i leden (t.ex. låg cellulärhet av brosk och menisk25) innebära utmaningar under experiment (t.ex. isolera hög kvalitet och kvantitet av RNA). Denna rapport behandlar dessa överväganden och presenterar ett protokoll för patientval, provbehandling, vävnad homogenisering, RNA extraktion och kvalitetskontroll (dvs. bedömning av RNA renhet och integritet; Bild 3) att uppmuntra användningen av primära mänskliga OA vävnader i forskarsamhället.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta studieprotokoll godkändes och följde institutionella riktlinjer som fastställts av Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Patientval

  1. Identifiera patienterna bland dem som är planerade att genomgå TKA med en ortopedisk kirurg.
  2. Välj patienter baserat på de behörighetskriterier som definieras i studieprotokollet. Exempel på inklusionskriterier är att vara 18 år eller äldre och ha en bekräftad diagnos av knä artros. Exempel på uteslutning kriterier är att genomgå partiell knä ersätter eller har en bekräftad diagnos av reumatoid artrit.
  3. Kontakta patienterna för att få informerat samtycke före operationen.

2. Provbehandling (för RNA)

OBS: Utför all vävnadsbehandling i ett biosäkerhetsskåp av klass II och följ sterila tekniker. Använd alltid lämplig personlig skyddsutrustning (nitrilhandskar, labbrock, skyddsglasögon) vid bearbetning av mänskliga prover. Flera benfragment produceras under TKA, en stor mängd ben / brosk kommer potentiellt att finnas tillgängliga för dissekering. På grund av sjukdomsprogression kan artikulär broskdegeneration vara allvarligare på vissa bendelar, som kan beaktas i experimentell design. Endast vävnader som kräver elektrocautery för samband har termisk kantskada, och en samordnad kirurgisk ansträngning görs för att skaffa de flesta vävnader med en skalpell för att minimera skador. Vidarebosatta vävnader måste alltid hållas hydratiserade med steril PBS.

  1. Desinficera alla arbetsytor och all utrustning med 70% etanol, RNase decontaminant, DEPC-behandlat vatten och igen med 70% etanol. Torka bort restvätska med rena, luddfria vävnader. Tång, benskärare och skalpeller är antingen autoklaverade eller dränkta i 70% etanol i minst 10 minuter före användning. Förvara utrustningen nedsänkt i 70% etanol när den inte används omedelbart.
  2. Förmärka minst tre cryovialer med avidentifierat provnamn och alikvotnummer för varje vävnad (t.ex. TKA-1 Brosk 1).
    1. Identifiera varje vävnadstyp från provexemplaret baserat på skillnaderna i storlek, form, färg och textur enligt figur 2. Identifiera brosk(figur 2A pil), ben(figur 2B pil), menisk(figur 2C),infrapatellar fett pad (figur 2D), främre korsband (figur 2E), synovium (figur 2F) och vastus medialis sned muskel (figur 2G).
  3. Isolera ledbrosket.
    1. Välj en bendel med minimal brosknedbrytning.
    2. Använd en skalpell nr 10 och skär genom broskdjupet så långt det är möjligt för att dissekera broskskiktets fulla tjocklek.
      OBS: En skalpell nr 10 penetrerar endast brosk, inte ben.
    3. Dissekera tre 5 mm kuber med hjälp av broskets fulla tjocklek.
  4. Isolera subchondralbenet.
    1. Använd samma bensektion från vilken brosk samlades in.
    2. Använd en skalpell nr 10 och skrapa eventuella kvarvarande brosk och kvarvarande vävnader från benytan.
    3. Håll bendelen som ska skäras med tång och använd benskärarna för att skära tre 5 mm kuber.
  5. Isolera menisken.
    1. Identifiera en relativt oskadad del av antingen mediala eller laterala menisk.
    2. Dissekera tre 5 mm kuber med hjälp av en skalpell och tång nr 10.
  6. Isolera infrapatellar fettkudden.
    1. Skär den gula delen av vävnaden med hjälp av en skalpell och tång nr 10 i tre lika stora och homogena portioner (~500 mg vardera).
  7. Isolera det främre korsbandet (ACL).
    1. Dissekera tre 5 mm kuber med hjälp av en skalpell och tång nr 10.
  8. Isolera synoviumet.
    1. Använd en skalpell och tång nr 10 och isolera den rosa celldelen av membranet så mycket som möjligt genom att skrapa bort fettvävnad.
    2. Dissekera tre lika stora och homogena portioner (~200 mg vardera).
  9. Isolera vastus medialis sned muskel (VMO).
    1. Använd en skalpell och tång nr 10 och ta bort eventuell fettvävnad från provet och lämna endast den röda muskelvävnaden.
    2. Dissekera tre 5 mm kuber.
      OBS: Vävnadens ursprungliga storlek begränsar storleken på portionerna.
  10. Skölj vävnadsdelarna med steril PBS för att avlägsna eventuella rester eller skräp.
  11. För att utföra histologi, fixera varje vävnadsdel enligt beskrivningen i del 3.
  12. För att utföra RNA-extraktion, skär var och en av de tre vävnadsdelarna i mindre bitar (~ 1-2 mm   kuber).
    1. Överför de mindre bitarna till en 2 mL cryovial, säkra lock tätt, blixtfrys genom att sänka i flytande kväve i 30 s och överför sedan till en frys på -80 °C för långtidsförvaring (upp till 4 månader testad i det aktuella protokollet). Upprepa detta för alla alikvoter i alla vävnader.
    2. Fortsätt till vävnads homogenisering enligt beskrivningen i del 4.

3. Provbehandling (för histologi)

VARNING: Formalin är en farlig kemikalie, använd endast i en kemisk rökhuv.

  1. Fyll förmärkta koniska rör på 15 ml med 10% formalinlösning.
  2. Överför vävnadssektionen med hjälp av tång till de formalinfyllda rören.
  3. Fixera vävnaderna i formalin i 1 vecka vid rumstemperatur medan du skakar/omrör om möjligt.
  4. Efter 1 vecka kassera formalin i korrekt kemisk avfallshantering, skölj vävnaderna med PBS och överför sedan till ett färskt koniskt rör på 15 ml som innehåller 70 % etanol för långtidslagring vid 4 °C tills proverna är inbäddade för sektionering.
    OBS: Endast för ben/brosk, utför avkalkning enligt följande.
  5. Efter 1 vecka, kassera formalin i korrekt kemisk avfallshantering och skölj vävnaderna med PBS.
  6. Överför vävnaden till ett koniskt rör på 50 ml med 45 ml 10 % EDTA-lösning (pH 7,4).
  7. Om det inte är möjligt att skaka/omröra, vänd rören 10-15 gånger en gång dagligen.
  8. Kassera och byt ut EDTA-lösningen en gång i veckan.
    1. Testa texturen två gånger i veckan med ett instrument (dvs spatel) eller handskefinger för att bekräfta avkalkningen genom att observera deformation när tryck appliceras. Den tid som krävs för att avkalka benvävnad varierar mellan proverna från 4-6 veckor.
  9. Skölj vävnaden med PBS och överför till ett färskt koniskt rör på 15 ml som innehåller 70 % etanol för långtidslagring vid 4 °C tills proverna är inbäddade för sektionering.

4. Vävnad homogenisering

VARNING: Protokollet använder den farliga kemiska fenolen. Arbete med fenol måste utföras i en kemisk rökhuv.

OBS: Rengör noggrant all utrustning och alla ytor som ska användas med 70% etanol (blötlägg i minst 10 min), följt av RNase decontaminant (blötlägg i minst 10 min), skölj med DEPC-behandlat vatten, torka med en ren, luddfri pappershandduk och sedan respraya eller blötlägg med 70% etanol.

  1. Homogenisering av hårdvävnad (ledbrosk, subkralben, menisk)
    1. Innan homogenisering, kyl mortel, mortel och spatel med flytande kväve. Dessa måste hållas så kalla som möjligt för att förhindra provupptining.
    2. Bearbeta proverna en i taget och håll de andra proverna vid -80 °C tills de används.
    3. Överför vävnadsprovet till murbruk med en kyld spatel; häll ytterligare flytande kväve ovanpå vävnaden och låt det avdunsta. Krossa vävnaden med pestle. Tillsätt upprepade gånger mer flytande kväve till vävnadsprovet, låt det avdunsta och fortsätt sedan slipa med pesteln för att göra ett fint pulver.
    4. Efter pulverisering av vävnaden så mycket som möjligt, överför till ett förkylt 1,5 ml mikrocentrifugerör.
      1. Förkylningsrör genom att dränka i flytande kväve i 30 s före vävnadsöverföring.
    5. Tillsätt 1 ml syra-guanidinium-fenollösning till varje rör och håll den på is.
    6. Upprepa steg 4.1.3-4.1.5 för varje prov på hårdvävnad.
    7. Rengör mortel, mortel och spatel med 70% etanol, RNase decontaminant, DEPC-behandlat vatten och ytterligare en blötläggning i 70% etanol. Torka av eventuell kvarvarande vätska med en ren, luddfri vävnad.
    8. Inkubera proverna på is i ytterligare 20 minuter.
  2. Mjukvävnad homogenisering (infrapatellar fett pad, ACL, synovium, VMO)
    1. Desinficera homogenisatorn genom att köra rör med 70% etanol, RNase decontaminant, DEPC-behandlat vatten och ytterligare 70% etanoltvätt, vardera för 30 s. Torka av eventuell kvarvarande vätska med en ren, luddfri vävnad. Upprepa detta mellan varje prov.
    2. Företikett 5 ml runda bottenrör för varje prov. Tillsätt 1 ml syra-guanidinium-fenollösning till varje rör.
      1. Arbeta med ett prov i taget och se till att andra prover bearbetas vid -80 °C tills det används.
    3. Överför vävnaden till ett förmärkt 5 ml-rör med syra-guanidiniumfenol.
    4. Homogenisera vävnaderna i 30 s pulser, håll på is under och mellan pulser. Upprepa tills vävnaden är visuellt upplöst eller i högst fem 30 s pulser.
      OBS: Vissa fibrösa vävnader (dvs. muskler) kanske inte homogeniseras grundligt.
    5. Inkubera den upplösta vävnaden på is och flytta till nästa prov.
      1. Rengör homogenisatorn enligt beskrivningen i steg 4.2.1. Se till att vävnadsbitar inte förblir i sondens tänder; ta bort med sterila tångar om det behövs.
    6. Efter homogenisering av alla prover, inkubera på is i syra-guanidinium-fenol i ytterligare 20 min.
    7. Överför proverna från runda bottenrör till förmärkta och förkylda 1,5 ml mikrocentrifugerör.

5. RNA-extraktion från vävnader

VARNING: Detta protokoll använder farliga kemikalier som fenol, kloroform och isopropanol. Utför allt arbete i en kemisk rökhuv.

OBS: Utrustning och reagenser är endast reserverade för RNA-arbete och måste vara av lämplig kemisk kvalitet för molekylära tillämpningar (dvs. sterila, nukleasfria). Detta protokoll efterträder både del 4.1 och 4.2 vävnad homogenisering protokoll. Rengör noggrant all utrustning och alla ytor som ska användas med 70% etanol (blötlägg i minst 10 min), följt av RNase decontaminant (blötlägg i minst 10 min). Skölj med DEPC-behandlat vatten, torka av restvätskan med en ren, luddfri pappershandduk och spreja eller blötlägg sedan med 70% etanol.

  1. Centrifugera mikrocentrifugerören vid 10000 x g i 10 min vid 4 °C för att pelletera skräpet.
  2. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL microcentrifuge-rör.
    OBS: För fettvävnader kommer ett lipidskikt ibland att finnas på toppen. Undvik att överföra detta genom att genomborra skiktet på sidan av röret med en pipettspets.
  3. Tillsätt 200 μL kloroform per 1 ml syra-guanidinium-fenollösning till varje prov. Skaka rören kraftigt för hand i 30 s för att blanda. Inkubera sedan på is i 2 min.
  4. Centrifugprover vid 10000 x g i 12 min vid 4 °C.
    OBS: Efter centrifugering kommer tre lager att ha bildats: en vattenfas som innehåller RNA, en vit DNA-interfas och en rosa proteinfas längst ner.
  5. Överför ~500 μL av den övre, vattenhaltiga fasen till ett färskt 1,5 ml mikrocentrifugerör.
    OBS: Stör inte interfasen och proteinfraktionerna. Förvara dessa faser vid -80 °C för framtida DNA- eller proteinisolering.
  6. Tillsätt en lika stor mängd syra-guanidinium-fenollösning till den överförda vattenfasen, blanda genom att invertera röret 8-10 gånger. Inkubera röret på is i 20 min.
  7. Tillsätt 200 μL kloroform per 1 ml syra-guanidinium-fenollösning till varje prov. Skaka kraftigt för hand i 30 s för att blanda och inkubera sedan på is i 2 min.
  8. Centrifugprover vid 10000 x g i 12 min vid 4 °C.
  9. Överför <500 μL vattenfasen till ett färskt mikrocentrifugerör, var noga med att inte förorena provet med de andra faserna.
    VARNING: Kassera de återstående faserna med lämpliga metoder för bortskaffande av farligt material.
  10. Tillsätt en lika stor volym (som vattenfas) på 100% isopropanol till varje prov. Blanda genom att vända röret 8-10 gånger. Inkubera på is i 5 min.
    1. Tillsätt 1 μL glykogenkoprecipitant till varje prov för att hjälpa till att lokalisera RNA-pelleten efter centrifugeringen.
  11. Centrifugera proverna vid 12000 x g i 25 min vid 4 °C.
  12. Leta reda på pelleten i röret (om du använder coprecipitant kommer den att se blå ut). Häll försiktigt av supernatanten.
  13. Tvätta pelleten genom att tillsätta 1 ml iskall 75% etanol till varje prov, virvel för att lossa pelleten från botten av röret.
    OBS: Förbered 75% etanol med molekylär kvalitet ren etanol och nukleasfritt vatten.
  14. Centrifug vid 7000 x g i 5 min vid 4 °C. Häll försiktigt av supernatanten.
  15. Upprepa steg 5.13 och 5.14 ytterligare två gånger.
  16. Snabbspinn (<2000 x g i 5 s) för att få eventuell kvarvarande vätska till botten av röret. Använd en P20-pipett för att avlägsna eventuell restetanol från rörens botten.
    1. Undvik att vidröra RNA-pelleten med en pipettspets. Ändra tips mellan exempel.
  17. Med rörlock öppna, lufttorka prover vid rumstemperatur i 10 min.
    OBS: Pellet kan bli genomskinlig när den torkar. Att se till att all restetanol har avdunstat kommer att förbättra RNA-renheten.
  18. Tillsätt 25 μL nukleasfritt vatten till varje rör för att lösa upp pelleten.
  19. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
  20. Rör försiktigt upp och ner för att blanda RNA.
  21. Alikvot 5 μL av provet i ett nytt rör för kvalitetskontrollanalys(del 6). Förvara de återstående 20 μL vid -80 °C för genuttrycksanalyser.

6. Kvalitetskontroll

  1. Bestäm RNA:s koncentration och renhet med hjälp av en spektrofotometer enligt tillverkarens instruktioner.
  2. Bestäm RNA-integriteten med hjälp av en elektroforesanordning enligt tillverkarens instruktioner.
    OBS: Späd ut RNA för att ligga inom intervallet för spåndetekteringsgränserna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sju unika mänskliga knäledsvävnader finns tillgängliga för insamling från patienter som genomgår TKA för OA (figur 1). I detta protokoll identifierades och bearbetades var och en av dessa vävnader inom 4 timmar från kirurgiskt avlägsnande(figur 2). Enligt stegen i figur 3var delar av varje vävnad formalin-fixerade för histologisk bedömning(figur 4), medan andra delar var flashfrysta för RNA-isolering. Separera hårda vävnader från mjuka vävnader genom desintegrationsmetod (pulverisering kontra homogenisering), extraherades RNA med hög integritet och renhet från varje vävnadstyp, med representativa resultat som visas i tabell 1 (högkvalitativa kolumner). I synnerhet gav vissa ämnen lägre kvalitet RNA över flera vävnader(tabell 1, låg kvalitet kolumner), vilket tyder på att trots en optimerad metod, externa faktorer (t.ex. sjukdomens svårighetsgrad) kan påverka RNA kvalitet över vävnadstyper.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt för den mänskliga knäleden som visar ett sido tvärsnitt. Var och en av de sju märkta vävnaderna samlas in under TKA och används för forskningsändamål enligt beskrivningen i detta protokoll. VMO = vastus medialis sned muskel. Bild hämtad och ändrad från OpenStax College under en creative commons-licens26. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativa bruttobilder för var och en av de sju vävnader som erhållits från patienter som genomgår TKA. A)Främre lårbenssnitt med pil som pekar mot ledbrosk som ska samlas in. Brosk identifieras av ett vitaktigt skikt som finns på benytan. b)Främre lårbenssnitt med pil som pekar mot subkralben som skall samlas in. C)Menisk. Undvik att samla in brända sektioner orsakade av elektrocauterisering under TKA. (D) Infrapatellar fettkudde (gul i färg). (E) Främre korsband (vit, fibrös, svampig vävnad). f)Synovium. Ena sidan kommer att se ljus färgad och fibrös, ofta innehållande fettvävnad, medan den motsatta sidan kommer att verka rosa och mindre fibrös. Membranets rosa sida innehåller synovialfodret. G) Vastus medialis sned muskel (röd). Detta kan ofta vara den minsta vävnadsdelen och kan innehålla en del fettvävnad. Skalningslist = 2 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Översikt över de åtgärder som vidtagits för att samla in primära mänskliga OA-vävnader för histologi och RNA. Detta protokoll beskriver patientens urval, prov bearbetning för histologi och RNA, vävnad homogenisering för hårda vävnader och mjuka vävnader, RNA extraktion och kvalitetskontroll för sju primära mänskliga knä OA vävnader. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Histologiska sektioner för var och en av de sju vävnader som erhålls från patienter som genomgår TKA. Hematoxylin- och eosinfärgade sektioner visas vid 6x förstoring i panelerna A-F med infälld till 40x i panelerna A'-F' och A". (A, A') Ledbrosk; Subkralben(A, A). B, B'menisk; (C, C') infrapatellar fett pad; (D, D') främre korsband; (E, E')synovium; (F, F ') vastus medialis sned muskel. Skalstänger = 400 μm för A-F och 50 μm för A'-F' och A". Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Vävnad N RIN [RNA] (ng/μL) i 25 μL A260:A280 A260:A230
Hög kvalitet Låg kvalitet Hög kvalitet Låg kvalitet Hög kvalitet Låg kvalitet Hög kvalitet Låg kvalitet Hög kvalitet Låg kvalitet
"Hårda vävnader"
Ledbrosk 10 4 7,0 ± 0,8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1.80 ± 0.09 1.47 ± 0.34 1.40 ± 0.36 0,45 ± 0,26
Subchondral ben 10 4 7,8 ± 0,6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0.05 1.90 ± 0.17 1,72 ± 0,27 1.12 ± 0.62
Menisk 10 4 7,5 ± 0,6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0.05 1.71 ± 0.15 1.41 ± 0.47 0,77 ± 0,59
"Mjuka vävnader"
Infrapatellar Fett pad 10 3 8,5 ± 0,6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2.02 ± 0.03 2.09 ± 0.17 1.47 ± 0.71
Främre korsband 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1.91 ± 0.18 1,88 ± 0,20 1.35 ± 0.70
Synovium 9 3 8,5 ± 0,6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1,99 ± 0,04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
Vastus Medialis Sned 9 3 8,5 ± 0,6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1.96 ± 0.03 1,99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Tabell 1. Kvalitet och kvantitet av RNA isolerat från OA vävnader som samlats in från TKA patienter. RIN = RNA-integritetsnummer. Data som presenteras som medelvärde ± standardavvikelse för RIN, A260:A280 och A260:A230-förhållanden och medelvärde (intervall) för RNA-koncentrationsvärden. Högkvalitativa prover består av patienter från vilka alla vävnadstyper gav RNA med RIN > 6 (n = 8-10). Prover av låg kvalitet består av patienter från vilka flera vävnadstyper gav RNA med RIN < 6 (n = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som presenteras har visat sig vara framgångsrikt för att samla in sju primära mänskliga OA-vävnader för RNA-extraktion(tabell 1) och histologisk bearbetning(figur 4). Innan du samlar in patientprover är det nödvändigt att upprätta ett IRB-godkänt protokoll, helst i samarbete med en kirurg eller ett kirurgiskt team. Att tillämpa ett standardiserat protokoll för provsamling (t.ex. omsektion från konsekventa platser på plats) är avgörande för att maximera experimentell reproducerbarhet. Vävnadsprover ska transporteras till labbet i sterila behållare och bearbetas inom 4 timmar från operationen för att undvika nedbrytning. Under vävnadsdissektion och bearbetning hålls alla vävnader hydratiserade i steril PBS och sköljs i färsk, steril PBS för att avlägsna potentiella ytföroreningar som biofluider och annat oönskat skräp innan de blixtfryses för RNA-extraktion eller formalin-fixeras för histologi. En användbar tillämpning av histologisk analys är bekräftelse av vävnadstyperna och sjukdomens svårighetsgrad eftersom dessa kan särskiljas av cellnummer, fördelning och morfologi, bland andra faktorer som kan observeras av standardfläckar som hematoxylin och eosin (figur 4).

Primära mänskliga OA-vävnader kan innebära utmaningar för att extrahera RNA av tillräcklig kvantitet och kvalitet, enligt definitionen i renhet och integritet27. RNA-kvantitet är en funktion av vävnadens totala celluläritet, och i knäleden finns det lågcelliga, högmatrisvävnader som brosk, ben och menisk, och relativt högcelliga, lågmatrisvävnader som fettkudden, ACL, synovium och VMO. Till exempel kännetecknas både artikulär hyalinbrosk och meniscal fibrocartilage28 av låg cellulärhet, med den extracellulära matrisen som innehåller olika mängder kollagen, proteoglykaner och andra glykoproteiner28,29. Att ha färre celler resulterar i mindre RNA per volym vävnad (minskande mängd) och att ha mer protein resulterar i samrening med RNA (minska renheten)25,30. RNA-renhet kan bestämmas av spektrofotometri där A260:A280 och A260:A230 värden på <1,5 återspeglar förekomsten av organiska föroreningar (t.ex. protein) och värden på ~2,0 återspeglar rent RNA31. RNA-integriteten återspeglar nedbrytningsnivån, oavsett om den orsakas av experimentella tillstånd (dvs. skjuvningskrafter) eller av enzymatisk matsmältning (t.ex. nukleaser), och bestäms ofta av elektroforisk analys. Ett RNA Integrity Number (RIN) på 1 återspeglar försämrat RNA och en RIN på 10 återspeglar intakt RNA31,32. För RNA-sekvensering rekommenderas ofta minst RIN på 733,34,35. Data som presenteras i tabell 1 visar att dessa A260:A280, A260:A230och RIN trösklarna uppfylldes över alla vävnader från patientproverna i högkvalitativa RNA-gruppen jämfört med patientprover i lågkvalitativa RNA-gruppen, med undantag för några A260:A230 som kan återspegla proteinförorening av RNA i vävnader med låg cell och hög matris. Även om det finns många faktorer som kan bidra till kvaliteten på RNA isolerat från ett givet patientprov, bland dem kan vara graden av sjukdomens svårighetsgrad. Den sjuka naturen hos OA vävnader tyder på degradativa processer sker genom ökade nivåer av enzymer som kan smälta vävnader, men också RNA, vilket minskar kvaliteten.

Detta protokoll för RNA-extraktion syftar till att maximera RNA mängd och kvalitet från primära mänskliga OA vävnader. Det mest kritiska steget gällde huruvida vävnaderna upplöstes genom att pulvriseras eller homogeniseras, och detta konstaterades korrelera med vävnadens cellulära och matrissammansättning. Ursprungligen utsattes alla sju vävnader för samma protokoll där vävnader först pulveriserades av mortel och pestle med flytande kväve, sedan överfördes till syra-guanidinium-fenol lösning och ytterligare homogeniserades med hjälp av en handhållen vävnad homogenisator. Denna metod producerade gynnsam RNA avkastning, renhet och integritet för fett pad, ACL, synovium och VMO (kollektivt mjuka vävnader; också, relativt högcellig, låg matris), men ogynnsamma resultat för brosk, ben och menisk (kollektivt hårda vävnader; också lågcelliga, hög matris). Baserat på dessa observationer delades de sju vävnaderna in i två grupper för ytterligare protokoll förfining. det observerades att den ytterligare homogenisering hade minimal effekt på ytterligare sönderfall de hårda vävnaderna efter de hade pulveriserats till ett fint pulver. Omvänt uppnåddes dissociation av mjuka vävnader framgångsrikt med homogenisering ensam och krävde inte pulverisering. Därför eliminerades homogeniseringen av de hårda vävnaderna och pulveriseringen av mjuka vävnader. Detta var fördelaktigt för att minimera skjuvningskrafter, bearbetningstid och temperaturfluktuationer, som alla kan förbättra RNA-integriteten. Två rundor fenol/kloroformfasseparation för alla sju vävnaderna utfördes, eftersom detta har rapporterats förbättra RNA-renheten utan att minska avkastningen31.

En potentiell begränsning av detta protokoll är den batcheffekt som kan uppstå genom att separera vävnaderna i två grupper om den experimentella designen kräver jämförelse mellan alla vävnader. Användning av pulverisering kontra homogeniseringsmetoder kan förändra tekniska (t.ex. bearbetningstid) och miljöförhållanden (t.ex. temperaturfluktuationer) som kan medföra variabilitet36. En andra begränsning är den potentiella inkonsekvensen i att identifiera, dissekera och orientera (för histologisk sektionering) vävnaderna inom och mellan ämnen. En tredje begränsning är vår oförmåga att bekräfta potentiella korrelationer mellan patientens sjukdom allvarlighetsgrad och RNA kvalitet i den aktuella rapporten. En fjärde begränsning är bristen på tillgång till friska kontrollvävnader för jämförelse. Även om kontrollprover kan vara tillgängliga från kadaver, är dessa mindre lättillgängliga än OA-vävnader från TKA. En experimentell strategi för att kringgå detta är att använda varje ämne som sin egen kontroll, oavsett om man gör jämförelser mellan vävnader eller inom vävnader som jämför behandling med kontroll eller lesionerad med bevarade områden. Slutligen tillåter användning av vävnadsexplanter för RNA-extraktion inte genuttrycksanalys av de enskilda celltyperna som utgör vävnaderna (t.ex. synovialfibblaster jämfört med synoviala makrofager37).

Trots de noterade begränsningarna är primära mänskliga OA-vävnader en värdefull resurs för forskning, som erbjuder fördelar jämfört med andra experimentella system för OA, inklusive bevarande av cellnisch23. Primära mänskliga OA vävnader kan dock vara underutnyttjade i forskning på grund av logistiska eller tekniska utmaningar. Detta protokoll beskriver patientens urval, prov bearbetning, vävnad homogenisering, RNA extraktion och kvalitetskontroll för att stödja användningen av de prover som erhållits från TKA. Efter provbehandling kan flera experimentella metoder följas, bland annat genuttryck och histologi. Mest relevant för det snabbt föränderliga omikfältet är förmågan att isolera tillräckliga mängder högkvalitativt RNA för tillämpningar som RNA-sekvensering38,39. Molekylära profiler kan jämföras inom och mellan vävnader från försökspersoner med specifika sjukdomsfenotyper (t.ex. baserat på ålder, kön och andra OA riskfaktorer). Insikter som erhållits kan informera nya terapeutiska vägar som lättare kan översättas tillbaka till OA-patientpopulationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna tackar studiedeltagarna som gjorde denna forskning möjlig och tillägnar denna rapport till nya forskare inom artrosområdet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

Biologi nummer 173
Vävnadsuppsamling och RNA-extraktion från den mänskliga osteoarthritiska knäleden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter