İnsan Osteoartrit Diz Ekleminden Doku Toplama ve RNA Ekstraksiyonu
Summary
Total diz artroplastisinden sonra hastalardan elde edilen primer dokular, osteoartrit araştırmaları için maksimal klinik çevrililebilirlik ile deneysel bir model sağlar. Bu protokol, insan osteoartritinde mekanistik araştırmayı desteklemek için RNA’nın yedi benzersiz diz dokusundan nasıl tanımlanıp işlenerek izole edilip izole edilecek anlatmaktadır.
Abstract
Osteoartrit (OA) en sık dizi etkileyen kronik ve dejeneratif bir eklem hastalığıdır. Şu anda tedavisi olmadığı için total diz artroplasti (TKA) yaygın bir cerrahi müdahaledir. TKA’dan elde edilen birincil insan OA dokularını kullanan deneyler, ex vivohastalık mekanizmalarını araştırma yeteneği sağlar. OA’nın daha önce esas olarak kıkırdağı etkilediği düşünülse de, şimdi eklemdeki birden fazla dokuyu etkilediği bilinmektedir. Bu protokol, diz ekleminde hastalık mekanizması araştırmasını desteklemek için yedi benzersiz dokunun her birinden hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolünü (RNA saflığına, bütünlüğüne ve verimine göre) açıklar. Bilgilendirilmiş onam ile OA için TKA uygulanan hastalardan örnekler alındı. Dokular, RNA için flaş dondurma veya histoloji için formalin fiksasyonu ile ameliyattan sonraki 4 saat içinde parçalandı, yıkandı ve depolandı. Toplanan dokular arasında eklem kıkırdağı, subkondral kemik, menisküs, infrapateller yağ pedi, ön çapraz bağ, sinovyum ve vastus medialis eğik kas vardı. Her doku tipi için RNA ekstraksiyon protokolleri test edildi. En önemli değişiklik, düşük hücreli, yüksek matrisli, sert dokular (kıkırdak, kemik ve menisküs olarak kabul edilir) ile nispeten yüksek hücreli, düşük matrisli, yumuşak dokular (yağ pedi, bağ, sinovyum ve kas olarak kabul edilir) için kullanılan parçalanma yöntemini içeriyordu. Pulverizasyonun sert dokular için, homojenizasyonun ise yumuşak dokular için uygun olduğu bulunmuştur. Bazı deneklerin birden fazla dokuda sürekli olarak diğer deneklere göre daha yüksek RNA bütünlük sayısı (RIN) değerleri verme eğilimi gözlendi ve bu da hastalık şiddeti gibi altta kalan faktörlerin RNA kalitesini etkileyebileceğini düşündürdü. Birincil insan OA dokularından yüksek kaliteli RNA’yı izole etme yeteneği, sıralama da dahil olmak üzere sofistike gen ekspresyon deneyleri için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar ve bu da hastalara daha kolay çevrilen klinik içgörülere yol açabilir.
Introduction
Diz, kaval kemiği ve uyluk kemiği arasındaki tibiofemoral eklemi ve patella ile uyluk kemiği arasındaki patellofemoral eklemi içeren insan vücudundaki en büyük sinovyal eklemdir1. Dizdeki kemikler eklem kıkırdağı ile kaplıdır ve menisküs, yağ, bağlar ve kas dahil olmak üzere çeşitli bağ dokuları tarafından desteklenir ve sinovyal bir membran, sinovyal sıvı dolu bir boşluk oluşturmak için tüm eklemi kapsüller1,2,3 ( Şekil1). Sağlıklı bir diz, ön düzlemde sürtünmesiz harekete izin veren mobil menteşe eklemi olarak işlev alır1,3. Patolojik koşullar altında hareket kısıtlanabilir ve ağrılı hale gelebilir. En sık görülen dejeneratif diz eklemi hastalığı osteoartrittir (OA)4. İleri yaş, obezite, kadın cinsiyeti, eklem travması ve genetik dahil olmak üzere OA gelişimine yatkın olan çeşitli risk faktörleri bilinmektedir, diğerleriarasında 5,6. Şu anda ABD’de semptomatik diz OA’sı olan tahmini 14 milyon kişi vardır, artan nüfus yaşı ve obezite oranları nedeniyle prevalans artmaktadır7,8. Başlangıçta kıkırdak hastalığı olarak kabul edilen OA, şimdi tüm eklemin bir hastalığı olarak anlaşılmaktadır9. OA’da yaygın olarak gözlenen patolojik değişiklikler eklem kıkırdak erozyonu, osteofit oluşumu, subkondral kemik kalınlaşması ve sinovyum iltihabı9,10’dur. OA için bilinen bir tedavi olmadığından, tedaviler öncelikle semptom (örneğin, ağrı) yönetimi11,12‘ye odaklanır ve OA son aşamaya ilerledikten sonra, eklem protezi ameliyatı genellikle13olarak belirtilir.
Eklem protezi ameliyatları, tüm tibiofemoral eklem ve patellofemoral eklemin değiştirilmesi de dahil olmak üzere total diz artroplasti (TKA) ile kısmi veya total diz protezleri olabilir. 2020 yılı itibariyle ABD’de her yıl yaklaşık 1 milyon TKA yapılmaktadır14. TKA sırasında, bir ortopedi cerrahı tibial platonun üst kısmını ve alt femoral kondilenleri (Şekil 2A, 2B) protez implantlarla donatılmak üzere resects. Bazen hastalar tarafından yanlış yorumlanır, bir TKA’da, her kemiğin ucundan sadece 8-10 mm resected, daha sonra kaplanır veya yeniden ortaya çıkar, metal ile. Birbirine ketilosen astar, iki metal implant arasındaki yatak yüzeyini (yani dolguyu) oluşturur. Ek olarak, eklemin birkaç yumuşak doku bileşeni, uygun eklem dengesini sağlamak için tamamen veya kısmen eksilir. Bu dokular arasında medial ve lateral menisküs (Şekil 2C), infrapateller yağ pedi (Şekil 2D), ön çapraz bağ (ACL; Şekil 2E), sinovyum (Şekil 2F) ve vastus medialis eğik kas (VMO; Şekil 2G) 15. TNA’lar genellikle OA tedavisi için başarılı olsa da, hastaların yaklaşık% 20’si ameliyat sonrası ağrının tekrarını bildirmektedir16. Prosedürün yüksek maliyeti ve göreceli istilacılığının yanı sıra, bu sınırlamalar OA’nın ilerlemesini azaltmak için alternatif tedavileri belirlemek için daha fazla araştırma ihtiyacına işaret etmektedir.
OA’da terapötik müdahale için yeni yollar sunabilecek hastalık mekanizmalarını araştırmak için hücreler, doku eksplantları ve hayvan modelleri de dahil olmak üzere deneysel sistemler kullanılabilir. Hücreler tipik olarak monolayer olarak kültürlenir ve birincil insan veya hayvan dokularından (örneğin, kıkırdaktan izole edilmiş kondrositler) veya ölümsüzleştirilmiş hücrelerden (örneğin, ATDC517 ve CHON-001 18)türetilir. Hücreler kontrollü bir kültür ortamında deneysel değişkenleri manipüle etmek için yararlı olsa da, hücre fenotiplerini etkilediği bilinen doğal eklem koşullarını yakalamaz19. OA’nın altında bulunan kimyasal, mekanik ve hücreden hücreye iletişimin karmaşık basamaklarını daha iyi özetlemek için, birincil insan veya hayvan doku örneklerinde, taze veya kültürlü eks vivo eksplant olarak kullanılsın, doku yapısını ve hücre mikroçevrimini korumak için bir alternatif bulunur20. Eklem in vivoincelemek için, küçük (örneğin, fare21)ve OA için büyük (örneğin, at22)hayvan modelleri (örneğin, cerrahi indüksiyon, genetik değişiklik veya yaşlanma yoluyla) da yararlıdır. Bununla birlikte, bu modellerden insan hastalığına çeviri anatomik, fizyolojik ve metabolik farklılıklarla sınırlanabilir, diğerleri arasında23. Deneysel sistemlerin avantajları ve dezavantajları göz önüne alındığında, türlere özgü olmanın ve birincil insan OA dokularının sunduğu hücre dışı nişi korumanın temel güçlü yanları, araştırma bulgularının çeviri potansiyelini en üst düzeye çıkarır.
Birincil insan OA dokuları TKA’yı takiben kolayca elde edilebilir ve bu da TKA’ların yüksek sıklığını araştırma için değerli bir kaynak haline getirir. Potansiyel deneysel uygulamalar arasında gen ekspresyolojisi ve histolojik analizler bulunmaktadır. Birincil insan OA dokularının bu araştırma yaklaşımları ve diğerleri için potansiyelini gerçekleştirmek için, özetlenen aşağıdaki temel hususlardır. İlk olarak, hasta örneklerinin kullanımı etik düzenlemeye tabidir ve protokollerin Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylarını karşılaması gerekir24. İkincisi, insan primer hastalıklı dokuların doğasında var olan heterojenlik ve yaş ve cinsiyet gibi değişkenlerin etkisi, diğerlerinin yanı sıra, dikkatli hasta seçimi (yani uygunluk kriterlerinin uygulanması) ve veri yorumlama ihtiyacını yaratır. Üçüncüsü, eklemdeki farklı dokuların benzersiz biyolojik özellikleri (örneğin, kıkırdak ve menisküs25’indüşük hücreselliği) deneyler sırasında zorluklara neden olabilir (örneğin, yüksek kalite ve RNA miktarını izole etmek). Bu rapor bu hususları ele alıyor ve hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrol (yani RNA saflığının ve bütünlüğünün değerlendirilmesi) için bir protokol sunuyor; Şekil 3) araştırma topluluğunda birincil insan OA dokularının kullanımını teşvik etmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol RNA ekstraksiyonu (Tablo 1) ve histolojik işleme için yedi birincil insan OA dokusunun toplanmasında başarılı olmuştur (Şekil 4). Hasta örneklerini toplamadan önce, ideal olarak bir cerrah veya cerrahi ekiple işbirliği içinde IRB onaylı bir protokol oluşturmak gerekir. Numune toplama için standartlaştırılmış bir protokol uygulamak (örneğin, tutarlı yerinde konumlardan rezeksiyon) deneysel tekrarlanabilirliği en üst düzeye …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu araştırmayı mümkün kılan çalışma katılımcılarına teşekkür ediyor ve bu raporu osteoartrit alanındaki yeni bilim insanlarına ithaf ediyor.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
References
- Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
- Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
- Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
- Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
- O’Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
- Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
- Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
- Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
- Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
- Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
- Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
- Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
- Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
- Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
- Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
- Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
- Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
- Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
- Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
- Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
- Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
- Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
- Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
- Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
- Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).
