Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

क्षेत्रीय-विशिष्ट मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के साथ एएलएस मॉडलिंग के लिए एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म की स्थापना

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62726
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

हम रीढ़ की हड्डी को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उनकी सह-संस्कृति।

Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स (HIPSC-A) और न्यूरॉन्स (HIPSC-N) विट्रो में एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (ALS) पैथोफिज़ियोलॉजी मॉडलिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं। मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी से विद्युत क्षेत्र क्षमता को रिकॉर्ड करने और समय के साथ नेटवर्क गतिविधि का विश्लेषण करने का एक साधन है। यह पहले प्रदर्शित किया गया था कि रीढ़ की हड्डी एस्ट्रोसाइट फेनोटाइप को बढ़ावा देने के लिए तकनीकों का उपयोग करके विभेदित एचआईपीएससी-ए की उपस्थिति ने क्षेत्रीय रूप से विशिष्ट रीढ़ की हड्डी एचआईपीएससी-मोटर न्यूरॉन्स (एमएन) की परिपक्वता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि में सुधार किया, जब एचआईपीएससी-ए के बिना या कृंतक एस्ट्रोसाइट्स की उपस्थिति में सुसंस्कृत लोगों की तुलना में। यहां वर्णित एचआईपीएससी-एमएन के साथ रीढ़ की हड्डी के एचआईपीएस-ए को सह-संस्कृति करने और एमईए रिकॉर्डिंग का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि रिकॉर्ड करने की एक विधि है। जबकि यहां वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के लिए विशेष हैं जो रीढ़ की हड्डी के लिए क्षेत्रीय रूप से विशिष्ट हैं, सह-संवर्धन मंच को एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स पर लागू किया जा सकता है, जो अन्य भाग्य के लिए विशिष्ट तकनीकों के साथ विभेदित हैं, जिसमें कॉर्टिकल एचआईपीएससी-ए और एचआईपीएस-एन शामिल हैं। इन प्रोटोकॉल का उद्देश्य ग्लिया-न्यूरॉन इंटरैक्शन के बारे में सूचित करने के लिए एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परख प्रदान करना और एएलएस में चिकित्सीय क्षमता के साथ दवाओं के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान करना है।

Introduction

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स (एचआईपीएससी-ए) और न्यूरॉन्स (एचआईपीएससी-एन) विट्रो में एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) पैथोफिज़ियोलॉजी मॉडलिंग के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं और दवाखोज रणनीतियों के लिए एक ट्रांसलेशनल प्रतिमान प्रदान करते हैं। शोधकर्ताओं ने प्रदर्शित किया है कि एचआईपीएससी-एन के साथ एचआईपीएससी-ए की सह-संस्कृति दोनों सेल प्रकारों के रूपात्मक, आणविक, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और फार्माकोलॉजिकल परिपक्वता को बढ़ाती है, जिससे जटिल न्यूरोनल नेटवर्क और एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शनउत्पन्न होते हैं जो विवो समकक्ष2,3 में उनके समान होते हैं। इसी तरह के सह-संस्कृति प्रयोग एस्ट्रोसाइट-मध्यस्थता न्यूरोटॉक्सिसिटी 4,5 और न्यूरोनल हाइपर-उत्तेजना6 जैसे एएलएस पैथोबायोलॉजी के हॉलमार्क को पुन: परिभाषित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, भेदभाव प्रोटोकॉल में प्रगति के साथ, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) को क्षेत्रीय रूप से विशिष्ट तंत्रिका उपप्रकारों में विभेदित किया जा सकता है, जिसमें कॉर्टिकल और रीढ़ की हड्डी हिपीएससी-ए और एचआईपीएससी-एन 7,8 शामिल हैं। ये रणनीतियाँ एएलएस में कॉर्टिकल और स्पाइनल मोटर न्यूरॉन पैथोलॉजी के साथ-साथ दोनों पर एस्ट्रोसाइटिक प्रभाव मॉडलिंग की क्षमता प्रदान करती हैं। हालांकि, इसके लिए आवश्यक है कि इन प्रभावों को निर्धारित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कार्यात्मक परख है।

हाल ही में यह दिखाया गया था कि मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) रिकॉर्डिंग विशेष रूप से न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट्ससह-संस्कृतियों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है। एकल-कोशिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण के विपरीत, ये उच्च घनत्व वाले इलेक्ट्रोड सरणी संस्कृति की स्थिति को बाधित किए बिना और कोशिका झिल्ली की अखंडता को संरक्षित किए बिना न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी से बाह्य क्षेत्र क्षमता को निष्क्रिय रूप से रिकॉर्ड करते हैं। ये प्लेटफ़ॉर्म समय के साथ संस्कृतियों की सेलुलर और नेटवर्क गतिविधि को रिकॉर्ड करने और फार्माकोलॉजिकल हेरफेर के जवाब में विशेष रूप से उपयोगी हैं। अंत में, जब एस्ट्रोसाइट्स की उपस्थिति एक संस्कृति चर है, तो एमईए रिकॉर्डिंग एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन द्विदिश इंटरैक्शन 2,9 में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।

यहां प्रस्तुत एचआईपीएस के भेदभाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है एचआईपीएस-ए और एचआईपीएससी-मोटर न्यूरॉन्स (एमएन) जिसेपहले मान्य किया गया है। रीढ़ की हड्डी एचआईपीएससी-ए भेदभाव प्रोटोकॉल लगातार एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों में परिणाम देता है, जो क्रमशः 80%, 50%, और 90% कोशिकाओं में एस 100 कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन बी (एस 100), ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी), और होमोबॉक्स बी 4 (एचओएक्सबी 4) के लिए सकारात्मक हैं, जो परिपक्व ग्लियल और रीढ़ की हड्डी विनिर्देश 2,10 का संकेत देते हैं। . HIPSC-MN भेदभाव प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है जो कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (CHAT) के लिए >90% सकारात्मक होते हैं, जो एक परिपक्व अल्फा-मोटर न्यूरॉन पहचान2 का संकेत देते हैं। एमएन सह-संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए तकनीकों का वर्णन करता है, जो पहले एस्ट्रोसाइट्स के बिना या कृंतक एस्ट्रोसाइट्स2 के साथ न्यूरोनल संस्कृतियों की तुलना में स्कोल विश्लेषण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा बढ़ी हुई रूपात्मक जटिलता के साथ न्यूरॉन्स में परिणाम देते हैं। हालांकि ये विवरण रीढ़ की हड्डी के HIPSC-A और HIPSC-N के लिए विशिष्ट हैं, एक अनूठा लाभ यह है कि एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स की प्रारंभिक स्वतंत्र संस्कृति के बाद बाद के समय बिंदुओं पर सह-संस्कृति के चरणों का अनुवाद अन्य विशिष्ट क्षेत्रों के साथ-साथ रोग-विशिष्ट कोशिकाओं 7,8 से न्यूरॉन-एस्ट्रोसाइट इंटरैक्शन केप्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। . अंत में, प्रोटोकॉल बताता है कि एमईए प्लेटों पर इन संस्कृतियों को कैसे विकसित किया जाए ताकि सह-संस्कृति संरचना के कारक के रूप में कार्यात्मक गतिविधि का अध्ययन सेलुलर संरचना के साथ-साथ संस्कृति स्थितियों में हेरफेर करने की क्षमता के साथ समय के साथ किया जा सके।

इन प्रोटोकॉल का लक्ष्य एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन की जांच करने, रोग-विशिष्ट परिवर्तनों की जांच करने और एएलएस के क्षेत्र में चिकित्सीय क्षमता के साथ दवाओं का परीक्षण करने के लिए एक कार्यात्मक परख प्रदान करना है। इस प्रोटोकॉल के सबसे चुनौतीपूर्ण चरणों के लिए वीडियो निर्देश प्रदान किए जाते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति मीडिया तैयारी

  1. तालिका 1 में उल्लिखित रचनाओं का उपयोग करके व्यक्तिगत सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें।
  2. 500 एमएल फ़िल्टर की गई बोतलों में मीडिया को मिलाएं और बाँझ फ़िल्टर करें, और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित स्टोर करें।

2. मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (HIPSC) को बनाए रखना और पास करना

  1. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (-80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में संग्रहीत) को रात भर 2-8 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में पिघलाएं।
  2. ठंडे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) या डलबेको के मॉडिफाइड ईगल्स मीडियम (डीएमईएम) में 1: 100 (वी / वी) पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को पतला करें।
  3. टिशू कल्चर प्लेट के तल को कोट करने के लिए पर्याप्त बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें (10 सेमी प्लेट के लिए 5 एमएल, 6-वेल प्लेट के एकल कुओं के लिए 2 एमएल) और रात भर में न्यूनतम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर न्यूनतम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. पतला बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें और कल्चर मीडिया और सीडिंग कोशिकाओं को जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ प्लेट को एक बार धो लें।
  5. यह निर्धारित करने और अनुमान लगाने के लिए रोजाना प्लेटों की जांच करें कि वे कब पारित होने के लिए तैयार हैं। एक बार अधिकांश कॉलोनियों के एचआईपीएस की मार्ग प्लेटें पर्याप्त रूप से घनी हो गई हैं ताकि कॉलोनियों का केंद्र बिखरे हुए सफेद क्षेत्रों को प्रदर्शित करे। प्लेटों को इस बिंदु से आगे परिपक्व न होने दें। यह सेल मल्टी-लेयरिंग, किनारों पर लम्बी कोशिकाओं की अधिकता, कॉलोनियों के भीतर ढीली कॉम्पैक्टनेस, या बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु के कारण कॉलोनियों के केंद्र में एक पीले क्षेत्र की उपस्थिति का कारण बनता है।
  6. मार्ग के दिन, पूरी प्लेट के सटीक कवरेज की सुविधा के लिए एक मार्कर के साथ प्लेटों की निचली बाहरी सतह पर ग्रिड लाइनें खींचें।
  7. फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (10x आवर्धन) का उपयोग करके एक संस्कृति हुड में विभेदित कॉलोनियों को अलग करें, जो मैन्युअल रूप से 200 μL पिपेट टिप के साथ स्क्रैपिंग करते हैं।
  8. प्लेटों को पीबीएस के साथ दो बार धोएं (10 सेमी प्लेटों के लिए 5 एमएल प्रति धोने)।
  9. पूर्व-गर्म ऊतक पृथक्करण प्रोटीज (सामग्री की तालिका) के 5 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि कॉलोनियों के किनारे गोल होने न लगें (4-7 मिनट), लेकिन प्लेट से उठाने से पहले।
  10. पृथक्करण प्रोटीज को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। धीरे से पीबीएस के साथ प्लेट को दो बार कुल्ला करें, सावधान रहें कि कॉलोनियों को हटा न दें।
  11. संस्कृति प्लेट में 5 एमएल पूर्व-गर्म एचआईपीएस माध्यम (तालिका 1) जोड़ें।
  12. कॉलोनियों को छोटे सेल समुच्चय में तोड़ते हुए ऊपर से नीचे की ओर गति का उपयोग करके 5 एमएल पिपेट की नोक के साथ पूरी प्लेट को खरोंचकर उठाएं।
  13. प्लेट को 90° घुमाएं और उपरोक्त चरण को दोहराएं।
  14. सेल समुच्चय को 5 एमएल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे करके धीरे-धीरे ट्राइट्यूरेट करें और माइक्रोस्कोप के तहत समय-समय पर समुच्चय के आकार की जांच करें जब तक कि सेल समुच्चय का अधिकांश भाग लगभग 50-100 कोशिकाएं न हों।
  15. मूल प्लेट को धोने के लिए एक अतिरिक्त HIPSC माध्यम का उपयोग करके, सेल समुच्चय को पूर्व-लेपित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्लेटों में बीज दें। 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके अधिकांश सेल समुच्चय को नई प्लेटों में इकट्ठा और स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि प्रोटोकॉल लगातार लागू किया जाता है, तो मूल प्लेट में आईपीएससी कॉलोनियां होनी चाहिए जो पारित होने से पहले संस्कृति की सतह के लगभग 50% को कवर करती हैं। इस मामले में, विभाजित अनुपात एक प्लेट से पांच नई प्लेटों तक होना चाहिए। हालांकि, इसे विकास की स्थिति और सेल लाइन-विशिष्ट विकास दर के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  16. समुच्चय को समान रूप से वितरित करने के लिए नए बीज वाली प्लेटों को आगे और पीछे हिलाएं।
  17. प्लेटों को एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) में स्थानांतरित करें, और उचित सेल आसंजन की अनुमति देने के लिए उन्हें रात भर अबाधित छोड़ दें।
  18. एचआईपीएससी माध्यम के 10 एमएल के साथ हर दिन एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें। यदि मार्ग के बाद के दिन अतिरिक्त सेलुलर मलबे हैं, तो मीडिया परिवर्तन से पहले माध्यम के 5 एमएल के साथ एक बार धोएं।
  19. आईपीएससी कॉलोनियों के बहुमत के केंद्र में सफेद क्षेत्र दिखाई देने पर आगे बढ़ने की योजना बनाएं (चरण 2.5)। यह प्रत्येक मार्ग के 4-6 दिनों के बाद होगा।

3. फ्रीजिंग हाईपीएससी

  1. HIPSC गद्यांश के लिए चरण 2.5-2.14 में दिए गए प्रारंभिक चरणों का पालन करें।
  2. सेल समुच्चय को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और 2 मिनट के लिए 200 x g पर स्पिन करें।
  3. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें, पेलेट को ठंड के माध्यम में फिर से निलंबित करें, और 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: मार्ग चरणों के समान, सामान्य विभाजित अनुपात कॉलोनियों के घनत्व के आधार पर एक आईपीएससी प्लेट से पांच क्रायोट्यूब है। प्रत्येक क्रायोट्यूब के लिए ठंड माध्यम के 1 एमएल की कुल मात्रा का उपयोग करें।
  4. क्रायोट्यूब को एक ठंडा क्रायोप्रिजर्वेशन कंटेनर में रखें और इसे रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  5. कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

4. हाईपीएससी को पिघलाना

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ 10 सेमी प्लेट को कोट करें (देखें 2.1-2.3)।
  2. तरल नाइट्रोजन से एक आईपीएससी क्रायोट्यूब निकालें और इसे जल्दी से पिघलने के लिए 2 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तुरंत रखें। स्नान में शीशी को तब तक हिलाएं जब तक कि यह आंशिक रूप से पिघल न जाए और इसमें तरल से घिरा बर्फ का एक छोटा टुकड़ा हो।
  3. सेल समुच्चय को क्रायोट्यूब से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 1000 μL पिपेट का उपयोग करके स्थानांतरित करें। फ्रीजिंग मीडिया में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) को पतला करने के लिए 15 एमएल प्री-वार्मेड एचआईपीएस माध्यम जोड़ें।
  4. 2 मिनट के लिए 200 x g पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और एचआईपीएस माध्यम में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करने के लिए 5 एमएल पिपेट का उपयोग करें, जिसमें 20 μM का Rho-संबद्ध कॉइल्ड-कॉइल बनाते हैं जो प्रोटीन सेरीन / थ्रेओनिन किनेज इनहिबिटर (ROCK-I, यौगिक Y-27632) बनाते हैं ताकि सेल समुच्चय के आगे के ट्राइट्यूरेशन से बचा जा सके।
  6. सेल समुच्चय को 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 10 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि प्रोटोकॉल लगातार लागू किया जाता है, तो एक क्रायोट्यूब में कोशिकाओं को एकल 10 सेमी प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है।
  7. समुच्चय को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को हिलाएं।
  8. प्लेट को एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और उचित सेल आसंजन की अनुमति देने के लिए इसे रात भर अबाधित छोड़ दें।
  9. रॉक-I के बिना 10 एमएल एचआईपीएससी माध्यम के साथ पिघलने के अगले दिन एक पूर्ण माध्यम परिवर्तन करें।

5. रीढ़ की हड्डी तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) में HIPSC को अलग करना

  1. सुनिश्चित करें कि बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स लेपित 6-वेल प्लेटें भेदभाव शुरू करने से पहले उपयोग करने के लिए तैयार हैं।
  2. आईपीएससी से शुरू करें जो कम से कम एक बार और अधिमानतः दो बार पिघलने के बाद और कम से कम चार 10 सेमी प्लेटों के साथ पारित किया गया है (चरण 5.11 में स्पष्टीकरण देखें)।
  3. HIPSC गद्यांश के लिए चरण 2.5-2.14 में दिए गए प्रारंभिक चरणों का पालन करें।
  4. सेल समुच्चय को कम से कम दो 10 सेमी प्लेटों से 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 2 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सुपरनैटेंट को एस्पिरेटेड करें और 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके 10 एमएल एचआईपीएससी माध्यम के साथ सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, और फिर प्रत्येक एग्रीगेट में सेल-टू-सेल आसंजन को ढीला करने के लिए 2 मिनट के लिए 200 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और 1000 μL पिपेट का उपयोग करके 20 μM ROCK-I युक्त HIPSC माध्यम के 1 एमएल में सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें।
  8. सेल समुच्चय को ट्राइट्रेट करने के लिए 1000 μL पिपेट के साथ ऊपर और नीचे करें। समय-समय पर माइक्रोस्कोप के तहत समुच्चय के आकार की जांच करें जब तक कि सेल निलंबन के बहुमत में एकल कोशिकाएं या <10 कोशिकाओं के छोटे समुच्चय शामिल न हों।
  9. हेमोसाइटोमीटर (पसंदीदा) या एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें और सेल निलंबन में सेल घनत्व की गणना करें।
  10. प्लेट 3.0 x 10 6 कोशिकाएं6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूर्व-लेपित होती हैं। सेल निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए 1000 μL पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: यदि प्रोटोकॉल लगातार लागू किया जाता है, तो यह 6-वेल / प्लेट के एकल कुएं में दो 10 सेमी प्लेटों के अनुपात से मेल खाता है।
  11. दो 10 सेमी प्लेटों के दूसरे बैच के साथ चरण 5.3-5.10 दोहराएं और अंतिम उत्पाद को एक बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में प्लेट करें जो दूसरी 6-वेल प्लेट के अच्छी तरह से लेपित है। सेल निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए 1000 μL पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: रीढ़ की हड्डी एनपीसी प्रोटोकॉल के आदर्श समापन के लिए चार 10 सेमी प्लेटों के बराबर दो कुओं की आवश्यकता होती है। वर्कफ़्लो में आसानी के लिए, दो प्लेटों के दो बैचों के साथ चरण 5.3- 5.10 को पूरा करें, प्रत्येक में अंतिम उत्पाद दो अलग-अलग 6-वेल प्लेटें हैं और प्रत्येक में 3.0 x 106 कोशिकाओं वाला एक कुआं है।
  12. परिणामी मानव आईपीएससी मोनोलेयर को एचआईपीएस माध्यम में बनाए रखें जिसमें 20 μM ROCK-I होता है जब तक कि संयोजन >90% तक नहीं पहुंच जाता है, आमतौर पर अगले दिन लेकिन सहज (अनियंत्रित) भेदभाव से बचने के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के 3 दिनों से अधिक समय तक नहीं।
  13. यदि सेल चढ़ाना के बाद के दिन विभेदन शुरू नहीं किया जा सकता है, तो कोशिकाओं को पीबीएस के साथ एक बार धो लें और मीडिया को रोजाना 20 μM ROCK-I युक्त एक नए HIPSC माध्यम में बदलें। यदि यह चढ़ाना के 3 दिनों के भीतर >90% का संगम नहीं करता है, तो कोशिकाओं को छोड़ दें और प्रोटोकॉल शुरू करें।
  14. एक बार >90% संगम तक पहुंचने के बाद, भेदभाव शुरू करें। यह भेदभाव प्रोटोकॉल के इन विट्रो 1 (DIV1) में दिन है।
  15. DIV 1 पर, 20 μM ROCK-I युक्त HIPSC माध्यम को छोड़ दें और भ्रूण के विकास कारक (FGF) को हटाने और स्टेम सेल माध्यम में मौजूद विकास कारक-बीटा (TGF) को बदलने के लिए पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला करें।
  16. माध्यम को WiCell माध्यम (तालिका 1) में बदलें, जिसे LDN193189 (LDN) के 0.2 μM और SB431542 (SB) के 10 μM के साथ 48 घंटे के लिए पूरक किया गया है।
  17. DIV 3 पर, पीबीएस के साथ एक बार धो लें और 48 घंटे के लिए LDN (0.5 μM) + SB (10 μM) + रेटिनोइक एसिड (RA; 1μM) के साथ पूरक माध्यम से WiCell माध्यम में बदलें।
  18. DIV 5 पर, पीबीएस के साथ एक बार धो लें और मीडिया को WiCell में बदलें: न्यूरल इंडक्शन मीडियम (NIM) बेस (तालिका 1) (50%: 50%, v/v) 48 घंटे के लिए LDN (0.5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) के साथ पूरक।
  19. DIV 7 पर, चरण 5.18 के समान माध्यम के साथ मध्यम विनिमय करें।
  20. DIV 8 पर, पीबीएस के साथ एक बार धोएं और माध्यम को WiCell: NIM बेस (50%:50%) में बदलें, जो आरए (1 μM) + प्यूरोमॉर्फामाइन (PMN) (1 μM) + पुनः संयोजक मानव-मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF) (10 ng / mL) + एस्कॉर्बिक एसिड (ASAC) (0.4 μg / mL) के साथ पूरक है।
  21. DIV 10 पर, पीबीएस के साथ एक बार धो लें और 48 घंटे के लिए चरण 5.20 में उल्लिखित माध्यम को एनआईएम बेस (100%) में बदलें।
  22. DIV 11 या 12 पर, मार्ग की तैयारी में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ25 सेमी 2 बाँझ संस्कृति फ्लास्क को कोट करें।
  23. 6-वेल प्लेट एल के प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें।
  24. प्रत्येक कुएं में 0.05% ट्रिप्सिन का 2 एमएल जोड़ें और 5-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें; रुक-रुक कर प्लेटों को हिलाने से सेल डिटेचमेंट में मदद मिल सकती है।
  25. यदि कोशिकाएं अभी भी निलंबन में नहीं हैं, तो 1000 μL पिपेट टिप से एनआईएम मीडिया को एक गोलाकार गति के साथ कोशिकाओं पर निकालकर यांत्रिक रूप से अलग करें (पूरी सतह को कवर करना सुनिश्चित करें), या सेल स्क्रैपर (पसंदीदा नहीं) के साथ स्क्रैप करके।
  26. कोशिकाओं को 2 कुओं से 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके उपयोग किए जाने वाले ट्रिप्सिन की मात्रा के लिए उपयुक्त अनुपात में ट्रिप्सिन अवरोधक जोड़ें।
  27. सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट के लिए 200 x g पर, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और फिर 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके 10 एमएल एनआईएम बेस के साथ फिर से निलंबित करें।
  28. सेल-टू-सेल आसंजन को ढीला करने के लिए 2 मिनट के लिए 200 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  29. दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और आरए (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0.4 μg/mL) और ROCK-I (20 μM) के साथ पूरक 1 mL NIM माध्यम (100%) के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। 1000 μL पिपेट टिप का उपयोग करके, कोशिकाओं को लगभग पांच बार ऊपर और नीचे ट्राइट्यूरेट करें जब तक कि बादल निलंबन प्राप्त न हो जाए।
  30. इस माध्यम में समुच्चय को 25सेमी 2 बाँझ कल्चर फ्लास्क लेपित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में फिर से बीज दें ताकि अंतिम परिणाम 6 वेल प्लेट के दो कुओं से एकल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 25 सेमी 2 बाँझ संस्कृति फ्लास्क (2 : 1 मार्ग) तक कोशिकाओं का संयोजन हो। सेल निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए 1000 μL पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: कोशिकाओं को DIV 13 पर >90% कॉन्फ्लुएंट होना चाहिए, और दिन 14 तक किसी और कदम की आवश्यकता नहीं है। यदि कोशिकाएं संकुचित नहीं हैं, तो रॉक-आई को अतिरिक्त 1 या 2 दिनों के लिए मीडिया में रखें।
  31. DIV 14 पर, मध्यम को ताज़ा NIM मीडिया + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0.4 μg/mL) में बदलें।
  32. DIV 15 पर, माध्यम को NIM में बदलें: तंत्रिका विभेदन माध्यम (एनडीएम) आधार (तालिका 1) (तालिका 1) (50%:50%) के साथ आरए (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0.4 μg/mL) + पूरक B (50x) + BDNF (10 ng/mL) + ग्लियल सेल लाइन-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक (GDNF) (10 ng/mL) + इंसुलिन-जैसे विकास कारक 1 (IGF-1) +10 ng/mL) + सिलियरी न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर (10 ng/mL) हर दूसरे दिन नए मीडिया के साथ बदलें।
  33. DIV 21 पर, चरण 5.32 में पूरक माध्यम को एनडीएम बेस (100%) में बदलें, और हर दूसरे दिन ताजा माध्यम के साथ बदलें।
  34. DIV 25-30 पर, NPC एकत्र करें और या तो उन्हें फ्रीज करें या टर्मिनल भेदभाव के लिए उन्हें 10 सेमी प्लेट में पारित करें।
  35. टी -25 फ्लास्क को पीबीएस के साथ धोएं और 0.05% ट्रिप्सिन जोड़ें।
  36. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  37. एनडीएम बेस के साथ ट्रिप्सिन और कोशिकाओं को धोएं और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्रिप्सिन अवरोधक को 5 मिनट के लिए 300 x g पर ट्रिप्सिन और सेंट्रीफ्यूज के लिए उपयुक्त अनुपात में जोड़ें।
  38. मोटर न्यूरॉन या एस्ट्रोसाइट भेदभाव माध्यम (तालिका 1) के साथ सेल गोली को पुन: निलंबित करें और एकल सेल निलंबन (आमतौर पर 5 बार तक) प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे ट्राइट्यूरेट करने के लिए 1000 μL पिपेट का उपयोग करें।
  39. कोशिकाओं की गणना करें और एचआईपीएससी-एमएन और एचआईपीएससी-ए को अलग करने के लिए विभेदन मीडिया + रॉक-1 का उपयोग करके अनुभाग 6 में वर्णित 10 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें।
  40. वैकल्पिक रूप से, विकास कारकों (चरण 5.32-5.33 में) और 10% डीएमएसओ के साथ 90% एनडीएम माध्यम से बने ठंड माध्यम में पुन: निलंबन करके संस्कृतियों को फ्रीज करें, इसी तरह से ट्रिट्यूरेट करें, और फिर क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें। Aliquot 6 x 106 NPC प्रति क्रायोट्यूब.

6. एनपीसी संस्कृतियों को पिघलाना

  1. कोशिकाओं को पिघलाने से एक दिन पहले पॉलीओर्निथिन (पीएलओ) और लैमिनिन के साथ 10 सेमी प्लेटों को कोट करें।
    1. प्लेटों में पीबीएस या आसुत जल (डीएच2ओ) में 100 μg / mL तक पतला 5 एमएल पीएलओ जोड़ें। रात भर कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. पीएलओ समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ प्लेटों को तीन बार कुल्ला करें। (पीएलओ विषाक्त है अगर ठीक से धोया नहीं जाता है।
    3. पीएलओ लेपित प्लेटों में 10 μg / mL की एकाग्रता के लिए पीबीएस में पतला लैमिनिन जोड़ें। न्यूनतम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, अधिमानतः रात भर। इनक्यूबेशन के बाद, सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए कुल्ला किए बिना लैमिनिन समाधान को एस्पिरेट करें।
      नोट: प्लेटों को समय से पहले पीएलओ के साथ लेपित किया जा सकता है, पानी के साथ तीन बार धोया जा सकता है, बाँझ हुड में सुखाया जा सकता है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट के लिए 6 x 106 कोशिकाओं / शीशी युक्त एक एनपीसी शीशी (यानी, DIV 25 या 30) को पिघलाएं।
  3. तरल नाइट्रोजन से एनपीसी क्रायोट्यूब को हटा दें और तुरंत 2 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। शीशी को हिलाकर जल्दी से पिघलाएं जब तक कि तरल से घिरा एक छोटा बर्फ का टुकड़ा न हो।
  4. सेल समुच्चय को 1000 μL पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार में स्थानांतरित करें और डीएमएसओ को पतला करने के लिए 15 एमएल पूर्व-गर्म एनडीएम या डलबेको के संशोधित ईगल्स मीडियम (डीएमईएम) / हैम के एफ 21 एफ 12 पूरक को जोड़ें।
  5. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें, सेल पेलेट को एस्ट्रोसाइट या एमएन भेदभाव माध्यम (तालिका 1) + रॉक-आई (20 μM) के साथ पुन: निलंबित करें और एकल सेल निलंबन प्राप्त होने तक ऊपर और नीचे ट्राइट्यूरेट करने के लिए 1000 μL पिपेट का उपयोग करें (5 बार तक)।
  7. एकल-सेल निलंबन को पीएलओ-लैमिनिन लेपित 10 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें।
  8. प्लेट को एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और उचित सेल आसंजन की अनुमति देने के लिए इसे रात भर अबाधित छोड़ दें।

7. रीढ़ की हड्डी एनपीसी को मोटर न्यूरॉन्स में अलग करना

  1. चरण 6.1-6.8 में उल्लिखित प्रारंभिक चरणों का पालन करें, जिसमें अंतिम माध्यम एमएन भेदभाव माध्यम + रॉक-आई (20 μM) है।
  2. चढ़ाना के अगले दिन, रॉक-आई के बिना एमएन भेदभाव माध्यम के साथ माध्यम का पूरा आदान-प्रदान करें, और फिर हर दूसरे दिन मीडिया को बदलें। सप्ताहांत में, शुक्रवार को और फिर सोमवार को कोशिकाओं को खिलाएं। सेल मलबे को हटाने के लिए आवश्यकता होने पर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
  3. एमएन विभेदन माध्यम + साइटोसिन अरबिनोसाइड (एआरए-सी) (0.02 μM) के साथ माध्यम को बदलें और 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें जब ग्लियल प्रतिबद्ध पूर्वज सेल समूहों में एकत्रित पोस्ट-माइटोटिक एमएन पूर्वजों के तहत एकल प्रसार फ्लैट कोशिकाओं के रूप में उभरते हैं।
    नोट: आमतौर पर, यह प्रारंभिक चढ़ाना के बाद पहले 7 दिनों के भीतर होता है, हालांकि सेल लाइन के आधार पर परिवर्तनशीलता हो सकती है।
  4. 48 घंटे के बाद, एआरए-सी युक्त माध्यम को एस्पिरेट करें, पीबीएस के साथ धीरे-धीरे संस्कृतियों को कुल्ला करें, और एआरए-सी के बिना माध्यम को ताजा एमएन माध्यम में बदलें।
  5. एआरए-सी के साथ उपचार के बाद, न्यूरोनल क्लस्टर के समय से पहले अलगाव को रोकने के लिए वैक्यूम एस्पिरेटर के बजाय मैनुअल पिपेट के साथ पुराने माध्यम को हटाकर हर दूसरे दिन (या सोमवार, बुधवार और शुक्रवार) मध्यम आदान-प्रदान करें। इसके अलावा, संस्कृति प्लेटों के लिए न्यूरोनल लगाव को और बढ़ाने के लिए सप्ताह में एक बार लैमिनिन 1 μg / mL के साथ एमएन माध्यम को समृद्ध करें।

8. रीढ़ की हड्डी एस्ट्रोसाइट्स में एनपीसी को अलग करना

  1. धारा 6 के अनुसार एनपीसी संस्कृतियों को पिघलाएं, एस्ट्रोसाइट भेदभाव माध्यम (तालिका 1) का उपयोग करते हुए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को 1% (एनएस + 1% एफबीएस) की मात्रा के साथ-साथ चढ़ाना के लिए रॉक-आई (20 μM) के साथ जोड़ा गया है।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम प्रतिस्थापन (तालिका 1) को समान कमजोर पड़ने वाले कारकों का उपयोग करके एफबीएस के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  2. चढ़ाना के बाद के दिन, रॉक-अवरोधक के बिना एनएस + 1% एफबीएस माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम बदलें, और फिर हर दूसरे दिन माध्यम बदलें। सप्ताहांत में, शुक्रवार को और फिर सोमवार को कोशिकाओं को खिलाएं। सेल मलबे को हटाने के लिए आवश्यकता होने पर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। यदि कोशिकाएं मरना जारी रखती हैं, तो सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए रॉक-आई (10 μM) के साथ मीडिया को पूरक करें। अमर कोशिकाओं का चयन करने की क्षमता को देखते हुए, रॉक-आई का उपयोग अक्सर या बहुत लंबे समय तक न करने के लिए सावधान रहें।
  3. एस्ट्रोसाइट्स को पास करने से पहले उन्हें कॉन्फ्लुएंट बनने की अनुमति दें।
    नोट: सेल का आकार समय के साथ बढ़ेगा, इसलिए पारित करने के लिए कोई निर्धारित संख्या नहीं है। विशिष्ट पासिंग अनुपात 1: 2 या 1: 3 है। खराब अस्तित्व या बहुत अधिक प्लेटों को पास करने के मामले में, दो (या अधिक, आवश्यकतानुसार) 10 सेमी प्लेटों को एक 10 सेमी प्लेट में संयोजित करें ताकि स्थिरता बनाए रखी जा सके।
  4. एस्ट्रोसाइट पूर्वज संस्कृतियों को पारित करने के लिए, प्लेटों को पीबीएस (एफबीएस को हटाने के लिए) के साथ एक बार धोएं, 5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन के साथ इनक्यूबेट करें, एनएस माध्यम + 1% एफबीएस में कोशिकाओं को इकट्ठा करें (एफबीएस ट्रिप्सिन को निष्क्रिय कर देगा), और फिर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एस्पायरेट करें, एनएस माध्यम + 1% एफबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और फिर एकल-सेल निलंबन में विभाजित करें। एनएस + 1% एफबीएस में कोशिकाओं को नई 10 सेमी प्लेटों में वितरित करें।
    नोट: एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों का विस्तार करने के अलावा, प्लेटों के बार-बार पासिंग किसी भी शेष पूर्वज कोशिकाओं को मारने के उद्देश्य से कार्य करता है जिन्होंने न्यूरोनल भाग्य चुना है। इसलिए, भले ही बहुत अधिक माइटोटिक दर न हो, प्लेटों को 1: 1 अनुपात में पारित किया जा सकता है यदि न्यूरोनल संदूषण प्रतीत होता है।
  5. उपज को बढ़ाने के लिए विभेदन के दौरान कोटिंग को निम्नानुसार बदलें।
    1. प्रारंभ में पिघली हुई एनपीसी संस्कृतियों और पीएलओ / लैमिनिन पर प्रारंभिक चढ़ाना के बाद पहले अंश को प्लेट करें।
    2. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर अपरिपक्व एस्ट्रोसाइट्स को प्लेट करें।
    3. प्लेट अधिक परिपक्व एस्ट्रोसाइट्स (यानी, 90 दिन के बाद) या तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, पीएलओ / लैमिनिन लेपित प्लेटों (आमतौर पर न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कृति के लिए), या अनकोटेड प्लेटों पर।
  6. संस्कृतियों को सिंक्रनाइज़ करने या बाद के प्रयोगों के लिए बचत करने के लिए 60-दिवसीय परिपक्वता अवधि में किसी भी समय एस्ट्रोसाइट पूर्वजों को फ्रीज करें। एनपीसी चरण से परे पिघलते समय, एस्ट्रोसाइट पूर्वजों को पीएलओ / लैमिनिन के बजाय तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटों पर पिघलाएं।
  7. DIV 90 पर और उसके बाद, एस्ट्रोसाइट अस्तित्व को बढ़ावा देने और उनके प्रसार को कम करने के लिए एनएस + 1% एफबीएस से एनएस + 5% एफबीएस में माध्यम को स्विच करें।

9. मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी प्लेटों में एमएन और रीढ़ की हड्डी एस्ट्रोसाइट्स का सह-संवर्धन

  1. मोटर न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को अलग करें और प्लेट करें जब वे एक ही दिन में उपयोग किए जाने के लिए तैयार होते हैं और मोटर न्यूरॉन्स के लिए डीआईवी 60 और एस्ट्रोसाइट्स के लिए डीआईवी 90 तक होते हैं।
  2. 24-अच्छी तरह से प्लास्टिक प्लेटों (सामग्री की तालिका) के साथ काम करते समय एमईए प्लेटों को चढ़ाना से एक दिन पहले या दिन में निम्नानुसार कोट करें।
  3. पानी या पीबीएस में पीएलओ को 100 μg / mL तक पतला करें।
    1. प्रत्येक कुएं में 15-20 μL जोड़ें (पिपेट आराम स्तर पर निर्भर), इलेक्ट्रोड और आसपास के क्षेत्र को कवर करने वाले कुएं के केंद्र पर एक बूंद बनाएं लेकिन कुएं की संपूर्णता नहीं।
    2. ध्यान रखें कि पिपेट टिप के साथ इलेक्ट्रोड को नुकसान न पहुंचे। प्रत्येक कुएं में एक ही सतह क्षेत्र की कवरेज सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मात्रा के अनुरूप रहें।
    3. न्यूनतम 1 घंटे (अधिमानतः 2 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीएलओ को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्लेटों में पर्याप्त आर्द्रता नहीं होने पर छोटी मात्रा सूख जाएगी। कोटिंग और रिकॉर्डिंग के दौरान पर्याप्त आर्द्रता सुनिश्चित करने के लिए कुओं के आसपास के डिब्बों में पानी जोड़ें।
  4. प्लास्टिक माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग करके जितना संभव हो उतना पीएलओ तैयार करें। ध्यान रखें कि इलेक्ट्रोड को न छुएं। 250 μL पानी से तीन बार धोएं। यदि धोने के लिए वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग कर रहे हैं, तो इलेक्ट्रोड सरणी के पास टिप की अनुमति न दें। तीसरे धोने के बाद, जितना संभव हो उतना पानी निकालें, आवश्यकतानुसार पिपेट टिप का उपयोग करें। ढक्कन हटाने के साथ सेल कल्चर हुड के नीचे सतह को सूखने दें।
  5. एक बार प्लेट की सतह सूख जाने के बाद, पीबीएस में 10 μg / mL तक पतला लैमिनिन जोड़ें। प्रत्येक इलेक्ट्रोड सरणी को कवर करने के लिए 15-20 μL का उपयोग करें। आर्द्रता डिब्बों में पानी जोड़ें, ढक्कन बदलें, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन पर कम से कम 2 घंटे के लिए रात भर तक वापस कर दें।
  6. चढ़ाना के दिन, पीबीएस के साथ एक बार एमएन और एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों को कुल्ला करें और कोशिकाओं को उठाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन 0.05% जोड़ें (5 मिनट)। ट्रिप्सिन अवरोधक युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें और यह सुनिश्चित करने के लिए प्लेटों को मध्यम या आधार से धोएं कि सभी कोशिकाएं एकत्र की गई हैं। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 300 x g पर और एकल सेल निलंबन के 1 एमएल उत्पन्न करने के लिए 1000 μL पिपेट के साथ पुन: निलंबित होता है। एमएन और एस्ट्रोसाइट्स को फिर से निलंबित करते समय, 20 μM ROCK-I को जोड़ने के साथ सह-संस्कृति माध्यम (तालिका 1) पर स्विच करें।
  7. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके समानांतर में एमएन और एस्ट्रोसाइट्स की गणना करें। गिनती और गणना करते समय, सेल निलंबन को कैप करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टायरोफोम रैक में रखें।
  8. संस्कृतियों को मोटर न्यूरॉन्स के लिए प्रति 5 μL और एस्ट्रोसाइट्स के लिए 2.5 x10 4 कोशिकाओं प्रति 5 μL की एकाग्रता पर पुनर्निलंबन करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। 5 मिनट के लिए 300 x g पर 1 एमएल सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें और गणना की गई मात्रा में पुन: निलंबित करें।
  9. बीज दिए जाने वाले वांछित कुओं की संख्या की गणना करें और इसे प्रत्येक सेल निलंबन के 5 μL से गुणा करें। न्यूरॉन और एस्ट्रोसाइट सस्पेंशन की आवश्यक मात्रा को 1: 1 अनुपात में मिलाएं और पूरी तरह से संयुक्त (आमतौर पर दो बार) तक पिपेटिंग द्वारा मिलाएं, लेकिन बहुत आक्रामक होने से बचें।
  10. पिपेट टिप का उपयोग करके एमईए प्लेट के प्रत्येक कुएं से लैमिनिन को हटा दें। प्रत्येक कुएं में अंतिम संयुक्त सेल निलंबन के 10 μL को स्थानांतरित करें, इलेक्ट्रोड सरणी को कवर करने वाली एक छोटी बूंद का निर्माण करें ताकि प्रति कुएं 5 x 104 MN और 2.5 x 104 एस्ट्रोसाइट्स का सेल घनत्व प्रदान किया जा सके।
    नोट: संयुक्त निलंबन में उच्च सेल घनत्व को सटीक और सुसंगत सेल गणना सुनिश्चित करने के लिए सीडिंग चरण के दौरान कुओं के बीच लगातार पुन: निलंबन की आवश्यकता होती है।
  11. प्लेटों को 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें। सेल की बूंद को परेशान न करने का ध्यान रखें और कोशिकाओं को प्लेटों पर प्रारंभिक संलग्नक बनाने की अनुमति दें।
  12. 20-30 मिनट के बाद, प्रत्येक कुएं की दीवार पर 250 μL नीचे पाइप करके प्रत्येक कुएं में गर्म सह-संस्कृति मीडिया + ROCK-I जोड़ें, इसके बाद विपरीत दिशा में उसी कुएं की दीवार के नीचे अतिरिक्त 250 μL जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर पर वापस करें।
  13. बीज बोने के अगले दिन प्लेटों की जांच करें (सह-संस्कृति दिवस 1)। यदि महत्वपूर्ण सेल मलबे या मृत कोशिकाएं हैं, तो रॉक -1 युक्त एक ताजा सह-संस्कृति माध्यम के साथ माध्यम का आदान-प्रदान करें। अन्यथा, सीडिंग (सह-संस्कृति दिवस 2) के बाद दूसरे दिन माध्यम को रॉक-1 के बिना सह-संस्कृति माध्यम में बदल दें। सप्ताह में दो बार अर्ध-मध्यम एक्सचेंज करें (एस्पिरेटेड 50% और वाष्पीकरण के लिए अंतिम मात्रा का 60% जोड़ें)।
  14. यदि एकल अच्छी तरह से 30 मिमी ग्लास प्लेटों (सामग्री की तालिका) के साथ एमईए सिस्टम का उपयोग कर रहे हैं, तो प्लेट तैयार करने में 2 या अधिक दिन लग सकते हैं। ऐसा करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
  15. 5-15 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन के साथ पिछले एमईए संस्कृतियों से कोशिकाओं और सेल मलबे को उठाएं।
  16. एस्पिरेट ट्रिप्सिन और पानी से तीन बार कुल्ला करें।
  17. 70% इथेनॉल जोड़कर निष्फल करें और 10 मिनट के लिए हुड में इनक्यूबेट करें। इथेनॉल को एस्पिरेट करें, और फिर तीन बार पानी से धो लें।
  18. पानी में प्रोटीज एंजाइम के साथ 1% आयनिक डिटर्जेंट लागू करें। प्लेटों को ढक्कन के साथ कवर करें और थर्मोप्लास्टिक फिल्म और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें, और फिर उन्हें रात भर कमरे के तापमान पर एक रॉकर पर छोड़ दें।
  19. डिटर्जेंट को एस्पिरेट करें, और फिर पानी से तीन बार धो लें।
  20. यदि प्लेटों को स्टोर करने की योजना बना रहे हैं, तो पर्याप्त मात्रा में पानी जोड़ें। प्लेटों को ढक्कन से कवर करें और उन्हें थर्मोप्लास्टिक फिल्म और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें, और उन्हें अगले उपयोग तक रेफ्रिजरेटर में छोड़ दें।
  21. यदि कोट करने की योजना बना रहे हैं, तो सतह को सेल कल्चर हुड के नीचे सूखने दें।
  22. यदि अतिरिक्त नसबंदी की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, पिछले संक्रमण या गैर-हालिया उपयोग), तो केवल इस बिंदु पर, एमईए प्लेटों को 30-60 मिनट के लिए हुड के नीचे पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश में उजागर करें।
    नोट: लगातार यूवी प्रकाश से बचने से इलेक्ट्रोड को नुकसान से रोका जा सकेगा। यूवी प्रकाश का उपयोग जब प्लेटों पर सीरम होता है तो गैर-कार्यात्मक इलेक्ट्रोड होंगे, यही कारण है कि इसका उपयोग केवल साफ प्लेटों पर किया जाना चाहिए।
  23. जब प्लेटें पूरी तरह से सूख जाती हैं, तो एमईए प्लेटों की कांच की सतह को चार्ज करने और कोटिंग प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए 1 मिनट के लिए प्लाज्मा सफाई के साथ आगे बढ़ें। प्लाज्मा एमईए प्लेट सफाई-चढ़ाना चक्र के हर 4-5 चक्रों में कम से कम एक बार साफ करता है।
    1. एक विकल्प के रूप में, जब प्लाज्मा सफाई संभव नहीं है या आवश्यक नहीं है, तो एमईए प्लेटों की सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में एफबीएस युक्त माध्यम जोड़ें और उन्हें रात भर इनक्यूबेटर में वापस कर दें।
  24. धारा 6 में ऊपर वर्णित पीएलओ / लैमिनिन कोटिंग का उपयोग करें। प्लाज्मा सफाई या एफबीएस युक्त माध्यम को बाहर निकालने और धोने के तुरंत बाद पीएलओ समाधान (पीबीएस में 100 μg) जोड़ें।
  25. निम्नलिखित घनत्व पर ऊपर दिए गए अनुसार कोशिकाओं को प्लेट करें: 1 x 105 hiPSC-A / प्लेट और 5 x 105 HIPSC-MN / प्लेट।

10. मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग

  1. 200 हर्ट्ज उच्च पास और 3 किलोहर्ट्ज कम पास फिल्टर के साथ बटरवर्थ फिल्टर का उपयोग करके, 12.5 किलोहर्ट्ज नमूना आवृत्ति पर कच्चे वोल्टेज डेटा को निकालें। बेसलाइन से वोल्टेज ≥6 मानक विचलन के तात्कालिक समय बिंदुओं के रूप में स्पाइक पहचान सेट करें। 100 एमएस में >5 स्पाइक्स के साथ एक गतिविधि के रूप में विस्फोट की पहचान करें। नेटवर्क गतिविधि को परिभाषित करें जब कुल सक्रिय इलेक्ट्रोड का 35% से अधिक 100 एमएस के भीतर आग लगा देता है, जिसमें प्रति नेटवर्क कम से कम 50 स्पाइक्स फट जाते हैं।
  2. सह-संस्कृति (सीसी) दिन 1 के बाद जितनी जल्दी हो सके रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    नोट: सीसी दिवस 3 से पहले विद्युत गतिविधि शायद ही कभी नोट की जाएगी।
  3. समान घनत्व पर समानांतर संस्कृतियों को प्लेट करें और जैव रासायनिक परख, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी), या क्यूपीसीआर के लिए उपयुक्त संस्कृति प्लेटों या कवरलिप्स में प्रतिकृतियां।
  4. 5% पर 37 डिग्री सेल्सियस एडी सीओ2 पर सेट तापमान के साथ रिकॉर्डिंग करें। प्लेटों को मशीन में स्थानांतरित करें और उन्हें रिकॉर्डिंग से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए समतुल्य करने की अनुमति दें।
  5. प्रायोगिक डिजाइन के आधार पर 1-15 मिनट से अधिक हर दूसरे दिन या साप्ताहिक आधार रेखा गतिविधि रिकॉर्ड करें। मध्यम विनिमय के बाद कम से कम 1 घंटे तक रिकॉर्ड न करें, और आदर्श रूप से प्रत्येक मीडिया एक्सचेंज के बाद 24 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
  6. संदूषण को रोकने के लिए, किसी भी रिकॉर्डिंग के बाद माध्यम (यानी, चरण 9.14 के रूप में आधा मध्यम विनिमय) को बदलें जिसमें बाँझ प्लेट के ढक्कन को बाँझ हुड (यानी, दवा यौगिकों का अनुप्रयोग) के बाहर खोला जाना है। दवाओं को धोने के लिए पूर्ण मध्यम आदान-प्रदान और वॉश करें यदि प्लेटों का उपयोग दवा उपचार से परे जारी रहने वाला है।
  7. विश्लेषण उद्देश्यों के लिए, प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम तीन तकनीकी और जैविक प्रतिकृति का उपयोग करें। एन ≥ 3 प्रतिकृति के साधन के रूप में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा को व्यक्त करें।

11. मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी पर औषधीय परख

  1. प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर सह-संस्कृतियों के एक अलग संयोजन का उपयोग करें: नियंत्रण एस्ट्रोसाइट्स के साथ एएलएस न्यूरॉन्स, एएलएस एस्ट्रोसाइट्स, एएलएस न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स के साथ नियंत्रण न्यूरॉन्स, नियंत्रण न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स।
  2. न्यूरॉन्स या एस्ट्रोसाइट्स को लक्षित करने वाले यौगिकों के क्षणिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभावों की जांच करते समय, प्लेट ढक्कन को हटाने लेकिन मशीन के ढक्कन को बंद करने के साथ न्यूनतम 1 मिनट के लिए बेसलाइन गतिविधि रिकॉर्ड करें।
  3. मैन्युअल रूप से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग को रोके बिना मशीन पर ढक्कन खोलें और कई कुओं का इलाज करते समय मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके उचित दवा वाहन (आमतौर पर ताजा माध्यम) के साथ माध्यम के 25 μL का आदान-प्रदान करें। ढक्कन को मैन्युअल रूप से बंद करें।
  4. अतिरिक्त 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड करें (या अधिक यदि महत्वपूर्ण वाहन-प्रेरित परिवर्तन हैं जिनसे संस्कृति को ठीक होने की आवश्यकता है)।
  5. मैन्युअल रूप से ढक्कन को फिर से खोलें और उसी वाहन में रुचि की दवा के साथ 25 μL माध्यम का आदान-प्रदान करें। ढक्कन को मशीन पर बंद करें और रिकॉर्डिंग जारी रखें।
    नोट: प्रशासित दवा / वाहन की रिकॉर्डिंग और मात्रा की अवधि भिन्न हो सकती है या प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  6. विश्लेषण उद्देश्यों के लिए, सुनिश्चित करें कि वाहन के अतिरिक्त इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापदंडों में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं भड़काते हैं। वाहन जोड़ने के बाद की तुलना में दवा के बाद गतिविधि के प्रतिशत परिवर्तनों की गणना करें और स्थितियों के बीच तुलना करें।
  7. अनुदैर्ध्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभावों की जांच करने के लिए, जैसे कि उम्मीदवार रोग-संशोधित दवाएं, चरण 11.2 में उल्लिखित बेसलाइन गतिविधि रिकॉर्ड करें। इसके लिए या तो उपयुक्त वाहन में रुचि की दवा युक्त सह-संस्कृति माध्यम या केवल वाहन वाले माध्यम का उपयोग करें।
  8. विश्लेषण उद्देश्यों के लिए, एएलएस से समय-बिंदु रिकॉर्डिंग की तुलना करें या नियंत्रण सह-संस्कृतियों को एक दूसरे के लिए दवाओं के साथ अनुदैर्ध्य रूप से इलाज किया जाता है और स्थितियों को नियंत्रित करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HIPSC-MN और रीढ़ की हड्डी HIPSC-A की पीढ़ी के लिए रीढ़ की हड्डी पैटर्निंग प्रोटोकॉल को चित्र 1 में उल्लिखित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एचआईपीएससी को गैर-कॉन्फ्लुएंट कॉलोनियों (चित्रा 2 ए) के रूप में बनाए रखा और पारित किया जाता है। न्यूरोजेनेसिस को एलडीएन 193189 और एसबी 431542 के अलावा दोहरे एसएमएडी अवरोध के माध्यम से शुरू किया जाता है, जो क्रमशः हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-बीटा (टीजीएफ-β) मार्गों को निष्क्रिय करता है। इस चरण के लिए एक मोनोलेयर-आधारित विधि का उपयोग किया जाता है जहां एचआईपीएस को एक अनुयायी मैट्रिक्स, यानी, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर चढ़ाया जाता है, ताकि न्यूरोएपिथेलियम जैसी 2 डी संस्कृति उत्पन्न की जा सके। रूपात्मक रूप से, तंत्रिका प्रेरण को बड़े नाभिक और गोल आकार के साथ आईपीएससी से न्यूरोएपिथेलियल (स्टेम) कोशिकाओं में संक्रमण द्वारा चिह्नित किया जाता है जो एक बड़े साइटोप्लाज्म और बेलनाकार आकार के साथ कसकर कॉम्पैक्ट होते हैं। ये कोशिकाएं क्षैतिज रूप से और लंबवत रूप से विभाजित होंगी, जिससे एक बहुस्तरीय उपकला उत्पन्न होगी (चित्रा 2 बी, आई)।

3 डी रणनीति (यानी, भ्रूण शरीर-आधारित) के विपरीत 2 डी के लिए वरीयता, साहित्य साक्ष्य11,12 पर निर्भर करती है जो सुझाव देती है कि पूर्व सेल-बाह्यपर्यावरणीय संकेतों को पेश करके रीढ़ की हड्डी पैटर्न को बढ़ावा दे सकता है। न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं को तब क्षेत्र-विशिष्ट, यानी, रीढ़ की हड्डी, तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) (चित्रा 1) उत्पन्न करने के लिए अस्थायी और स्थानिक रूप से पैटर्न किया जाता है। इस उद्देश्य के लिए दो प्रमुख मोर्फोजेन्स का उपयोग किया जाता है: रेटिनोइक एसिड, जो कॉडलाइजेशन निर्धारित करता है, और प्यूरमॉर्फामाइन, एक हेजहोग सिग्नलिंग एगोनिस्ट, जो उदर विनिर्देश का कारण बनता है। उनकी अनुपस्थिति में, एनपीसी की सेल-आंतरिक क्षेत्रीय पहचान रोस्ट्रल और पृष्ठीय 14,15,16 होगी।

DIV 15 से DIV 25-DIV 30 तक, इन NPC की क्षेत्रीय पहचान को मॉर्फोजेन्स के साथ मीडिया को पूरक करके प्रबलित किया जाता है। इसी समय, न्यूरोनल विकास कारकों और एक ग्लिोजेनिक साइटोकिन जैसे सिलिअरी न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर (सीएनटीएफ) के शुरुआती संपर्क में एनपीसी की मिश्रित आबादी उत्पन्न होती है (चित्रा 2 बी, ii)। रूपात्मक रूप से ये कोशिकाएं न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं की तुलना में कम संकुचित होती हैं, कुछ छोटी प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करती हैं, जो डीआईवी 12 में पासिंग के बाद कॉलमर एपिथेलियम के विघटन के बाद एक मोनोलेयर में व्यवस्थित होती हैं। करीब से देखने पर, इनमें से कुछ कोशिकाएं लम्बी होती हैं, जबकि अन्य कई प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करती हैं, जो क्रमशः ग्लियल बनाम न्यूरोनल भाग्य के प्रति प्रारंभिक प्रतिबद्धता को इंगित करती हैं।

न्यूरॉन्स इस मिश्रित आबादी से अनायास उभरेंगे जब तक कि ग्लिोजेनिक स्विच सक्रिय नहीं होता है (चित्रा 1 और चित्रा 2 बी, iii)। नॉच पाथवे इनहिबिटर, कंपाउंड ई के अलावा, कम एमएन भेदभाव17 को बढ़ाएगा। इन कोशिकाओं की रीढ़ की हड्डी की पहचान सीएचएटी अभिव्यक्ति के उच्च स्तर (चित्रा 2 सी, आई) द्वारा समर्थित है। इसके अतिरिक्त, यह पहले दिखाया गया हैकि इन मोटर न्यूरॉन्स की एक उप-जनसंख्या आईएसएल 1 + भी है।

एस्ट्रोसाइट भेदभाव जेएके / एसटीएटी मार्ग (चित्रा 1 और चित्रा 2 बी, iv) के सक्रियण के माध्यम से ग्लिोजेनिक स्विच द्वारा प्रेरित होता है। भ्रूण गोजातीय सीरम में निहित सीएनटीएफ और संभवतः अन्य साइटोकिन्स प्रस्तावित प्रोटोकॉल में इस उद्देश्य की सेवा करते हैं। समय भी एक आवश्यक कारक है, क्योंकि सेल-आंतरिक सुराग के कारण न्यूरॉनोजेनेसिस के बाद ग्लियोजेनेसिस अनायास पालन करेगा। DIV 90 के बाद, HIPSC-A एक परिपक्व फेनोटाइप प्रदर्शित करता है जैसा कि S100और GFAP अभिव्यक्ति 2,11 द्वारा इंगित किया गया है, जबकि उनकी रीढ़ की हड्डी की क्षेत्रीय पहचान HOXB4 (चित्रा 2C, ii)2,11,14 की >90% अभिव्यक्ति द्वारा समर्थित है।

HIPSC-MN और HIPSC-A के सह-संवर्धन की विधि इन सेल उपप्रकारों के एक साथ चढ़ाना के लिए उल्लेखनीय है, उन तकनीकों के विपरीत जहां न्यूरॉन्स एस्ट्रोसाइट संस्कृतियों के शीर्ष पर क्रमिक रूप से चढ़ाए जाते हैं। इन एक साथ सह-संस्कृतियों में, कोशिकाएं अनायास पुनर्व्यवस्थित होंगी, एस्ट्रोसाइट्स नीचे एक फीडिंग परत बनाते हैं और न्यूरॉन्स शीर्ष पर नेटवर्क में जुड़ते हैं (चित्रा 2 सी, iii)। इस रणनीति ने पहले2 को अन्य सह-संस्कृति रणनीतियों की तुलना में न्यूरॉन्स के अधिक समान वितरण की अनुमति देने के लिए दिखाया है, जहां ये सेल प्रकार क्लस्टर होते हैं।

मानव आईपीएससी-एमएन को अकेले या सह-संस्कृति में 24-वेल एमईए प्लेट (एन = 12 प्रति स्थिति) पर एचआईपीएस-ए के साथ चढ़ाया जाता है, जिसमें प्रत्येक कुएं में 16 इलेक्ट्रोड होते हैं (चित्रा 3 ए)। दो प्रतिनिधि कुओं से स्पाइकिंग गतिविधि के मोनो- या सह-संस्कृतियों और रैस्टर भूखंडों की चरण-विपरीत छवियां दिखाई गई हैं (चित्रा 3 बी, सी)। मानव आईपीएससी-ए एचआईपीएससी-एमएन की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परिपक्वता को बढ़ाता है, जैसा कि सह-संस्कृतियों में स्पाइकिंग और फटने की गतिविधि की काफी उच्च डिग्री द्वारा दिखाया गया है (चित्रा 3 डी)। यह HIPSC-MN की रूपात्मक और आणविक परिपक्वता पर HIPSC-A के प्रभावों को समानता देता है जिसे पहले प्रदर्शित किया गया है।

इस प्रोटोकॉल की कुछ तकनीकी चुनौतियों को वीडियो निर्देशों में विस्तृत किया गया है, जहां एमईए प्लेटफार्मों के साथ-साथ इन संस्कृतियों से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग का उपयोग करके चढ़ाना और रिकॉर्डिंग करने की तकनीकों को दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: रीढ़ की हड्डी के एचआईपीएस-एमएन और एचआईपीएस-ए और उनकी सह-संस्कृति की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल। सम्मिलित में, रीढ़ की हड्डी एनपीसी उत्पन्न करने के लिए 30-दिवसीय प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करें, जिसमें दिन-प्रतिदिन की क्रियाएं (ई एक्सचेंज माध्यम, पी मार्ग, या कोई कार्रवाई नहीं), सेल कल्चर बेस और पूरक (संरचना पर अतिरिक्त जानकारी के लिए, तालिका 1 और सामग्री की तालिका देखें)। (बी) वंशावली और सेल भाग्य प्रतिबद्धता योजनाबद्ध रूप से प्रतिनिधित्व किया जाता है। सह-संस्कृतियां तब उत्पन्न होती हैं जब परिपक्व HIPSC-MN (यानी, DIV 60) और HIPSC-A (यानी, DIV 90) को एक साथ मिश्रित और चढ़ाया जाता है। (बायोरेंडर के साथ बनाया गया चित्रण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान रूपात्मक परिवर्तन। (ए) एचआईपीएससी के चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप छवियां। पैनल (i) (कम शक्ति, 10x) और (ii) (उच्च शक्ति, 20x) सामान्य HIPSC दिखाते हैं, पैनल (iii) (10x) और (iv) (20x) एक विभेदित HIPSC कॉलोनी दिखाते हैं। स्केल बार = 200 μm और 50 μm. (B) DIV 5 (i), DIV 21 (ii) पर NPCs, और परिपक्व DIV 60 मोटर न्यूरॉन्स (iii) और DIV 90 एस्ट्रोसाइट्स (iv) पर न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाओं की प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप छवियां। स्केल बार = 100 μm और 50 μm (C) HIPSC-MN (i), HIPSC-A (ii) और उनकी सह-संस्कृति (iii) के 40x तेल पर प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री छवियां। परिपक्वता और क्षेत्र-विशिष्ट मार्करों को लक्षित किया गया था। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एचआईपीएससी-एमएन की मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग। (ए) प्लेटिंग के बाद डीआईवी 18 पर एकल एमईए प्लेट (एन = 24 कुओं) से औसत स्पाइकिंग गतिविधि का हीट मैप। पंक्ति A और B में कुएं (n = 12 कुएं / तकनीकी प्रतिकृतियां) अकेले HIPSC-MN की संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि पंक्ति C और D (n = 12 कुएं) में कुएं HIPSC-MN / HIPSC-A की सह-संस्कृतियां हैं। (बी) एमईए प्लेटों पर अकेले एचआईपीएससी-एमएन (एमएन) और एचआईपीएससी-ए (एमएन + एससीए) के साथ सह-संस्कृति में प्रतिनिधि चरण-विपरीत छवियां। अकेले सुसंस्कृत होने पर न्यूरॉन्स बड़े सेल समूहों में एकत्र होते हैं, जबकि एचआईपीएससी-ए के साथ एचआईपीएससी-एमएन की सह-संस्कृति के परिणामस्वरूप समान रूप से वितरित मोनोलेयर होते हैं। स्केल बार = 50 μm. (C) अकेले HIPSC-MN और HIPSC-A के साथ सह-संस्कृति में HIPSC-MN के साथ एकल कुएं से 120 सेकंड से अधिक रिकॉर्डिंग समय में स्पाइकिंग गतिविधि का प्रतिनिधि रास्टर प्लॉट। सभी इलेक्ट्रोड में नेटवर्क बर्स्ट गतिविधि को बैंगनी बॉक्स के साथ हाइलाइट किया गया है। (डी) पैनल ए में दिखाए गए एमईए प्लेट से एस्ट्रोसाइट्स के साथ सह-संस्कृति में अकेले न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स के बीच स्पाइकिंग और फटने की गतिविधि का परिमाणीकरण और तुलना (** पी < 0.001, **** पी < 0.0001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आज तक, एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन सह-संस्कृतियों के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए एचआईपीएससी- और एमईए-आधारित विधियों ने एएलएस6 के क्षेत्र में सीमित आवेदन पाया है और अभी भी पूरी तरह से मानव प्लेटफार्मों में नहीं है, मिर्गी9 के इन विट्रो मॉडलिंग के लिए उनके अधिक व्यापक उपयोग के विपरीत। हालांकि, इस मंच में एएलएस अनुसंधान में पैथोफिजियोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक प्रश्नों को संबोधित करने की क्षमता है, जैसे कि न्यूरोनल हाइपरएक्साइटेबिलिटी के तंत्र, न्यूरोटॉक्सिसिटी में एस्ट्रोसाइट योगदान, या रोग की प्रगति में नेटवर्क गतिविधि की भूमिका। इसके अतिरिक्त, यह मंच विट्रो में 9 महीने से अधिक समय तक संभावित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा के संग्रह की अनुमति देता है और इसलिए, चिकित्सीय क्षमता 2 के साथ यौगिकों के परीक्षण के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करताहै।

साहित्य में पाए गए HIPSC-N और HIPSC-A की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल मीडिया स्थितियों, संस्कृतियों के समय, उपज और परिपक्वता प्रोफाइल के संबंध में बड़े पैमाने पर भिन्न होते हैं। प्रस्तावित मंच का एक प्रमुख लाभ यह है कि एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को अलग-अलग विभेदित किया जाता है और बाद के समय में एक साथ दो सेल प्रकारों को चढ़ाकर एक साथ सुसंस्कृत किया जाता है। सेल घनत्व और समय के अनुकूलन के बाद, इस विधि का अनुवाद अन्य प्रोटोकॉल से प्राप्त सेल प्रकारों के साथ किया जा सकता है, जिसमें अन्य क्षेत्र-विशिष्ट कोशिकाएं भी शामिल हैं।

प्रस्तावित मंच के लिए सर्वोपरि मोटर न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स का क्षेत्रीय विनिर्देश है। जबकि प्रस्तावित प्रोटोकॉल सीएचएटी + एमएन और एचओएक्सबी 4 + एस्ट्रोसाइट्स उत्पन्न करने की अपनी क्षमता में रीढ़ की हड्डी विशिष्ट है, अच्छी तरह से स्थापित भेदभाव तकनीकों का उपयोग कॉर्टिकल पहचान प्रदर्शित करने वाले एचआईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि सीटीआईपी 2 + लेयर वी कॉर्टिकल मोटर न्यूरॉन्स18 और ओटीएक्स 2 + फोरब्रेन एस्ट्रोसाइट्स14 . इस प्रकार, प्रस्तावित मंच में कॉर्टेक्स और रीढ़ की हड्डी के तंत्रिका सर्किट, साथ ही साथ उनके कनेक्शन को मॉडल करने की क्षमता है।

एमईए रिकॉर्डिंग के लिए कई सिस्टम उपलब्ध हैं। अध्ययन के लिए सीओ 2 और तापमान नियंत्रण के साथ प्रति कुएं 16 इलेक्ट्रोड के साथ प्लास्टिक24-वेल एमईए प्लेटों को प्राथमिकता दी गई थी। यह मंच एकल वेल रिकॉर्डिंग पर आधारित प्रणालियों के विपरीत उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। प्लास्टिक प्लेटों की मुख्य सीमा यह है कि सतह बार-बार उपयोग पर गिरावट के लिए अधिक संवेदनशील हो सकती है। ग्लास एमईए प्लेटों पर आधारित सिस्टम में डेटा रिकॉर्डिंग गुणवत्ता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना, ऊपर उल्लिखित (20 से बार तक) उचित उपचार के बाद कई बार पुन: प्रयोज्य होने का लाभ है। हालांकि, इन प्लेटों की हाइड्रोफोबिक सतह को देखते हुए, ये उपचार और कोटिंग विधियां अधिक समय लेने वाली और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए आईपीएससी- और एमईए-आधारित तरीकों की मुख्य बाधाओं में से एक प्रयोगात्मक निष्कर्षों की परिवर्तनशीलता और प्रजनन क्षमता है। पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि न्यूरॉन्स की एमईए गतिविधि परिपक्वता पर निर्भर है जो कई कारकों से प्रभावित होती है, जिसमें एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स दोनों की पीढ़ी में उपयोग की जाने वाली उचित भेदभाव तकनीकें शामिल हैं, न्यूरॉन्स का सेल घनत्व, भेदभाव और परिपक्वता के दौरान न्यूरॉन्स के लिए एस्ट्रोसाइट्स का अनुपात, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन सह-संस्कृतियों का अनुक्रम2 . इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित इन चरों को मानकीकृत करना प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने का एक तरीका है। उच्च थ्रूपुट डेटा उत्पन्न करने वाले मल्टीवेल एमईए सिस्टम की पसंद प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार होगी। यदि किसी संस्कृति की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि किसी दिए गए समय बिंदु पर अपेक्षित से कम है, तो यह निर्धारित करना महत्वपूर्ण है कि सफल भेदभाव हुआ है और बहन संस्कृतियां जिन्हें इम्युनोसाइटोकेमिकल या जैव रासायनिक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है, सहायक हैं। यह देखते हुए कि कोशिकाओं की एक बहुत कम मात्रा शुरू में बीजित होती है, छोटी पाइपिंग त्रुटियों के परिणामस्वरूप सेल संख्या में अपेक्षाकृत बड़े बदलाव हो सकते हैं और इसलिए, घनत्व। एमईए प्लेटों का उपयोग करना जो सेल घनत्व के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन और मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, भी महत्वपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि को निम्नलिखित द्वारा समर्थित किया गया था: 2019 एमएससीआरएफएफ 5119 (एटी)। एनआईएनडीएस (सीडब्ल्यूएच), 2020 डोरिस ड्यूक चैरिटेबल फाउंडेशन क्लिनिकल साइंटिस्ट करियर डेवलपमेंट अवार्ड (सीडब्ल्यूएच)। 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 एमएससीआरएफडी 5122 (NJM)। हम एमईए प्लेटफॉर्म और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रदान करने के लिए डॉ राहा दस्तघेब और डॉ नॉर्मन हाउघे को धन्यवाद देते हैं, जिसका उपयोग हमने वर्णित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म को मान्य करने के लिए किया है। हम प्रोटोकॉल प्रदर्शन और फिल्मांकन के साथ उनकी सहायता के लिए खलील रस्ट को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B - B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease - Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 174 मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी बाह्य रिकॉर्डिंग स्क्रीनिंग परख रीढ़ की हड्डी ग्लिया मोटर न्यूरॉन एम्योट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस एचआईपीएस मोटर न्यूरॉन रोग रोग मॉडलिंग
क्षेत्रीय-विशिष्ट मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के साथ एएलएस मॉडलिंग के लिए एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्लेटफॉर्म की स्थापना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A.,… More

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O'Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter