Geïsoleerd longperfusiesysteem in het konijnenmodel
Summary
Het geïsoleerde konijnenlongpreparaat is een gouden standaardinstrument in longonderzoek. Deze publicatie heeft tot doel de techniek te beschrijven zoals ontwikkeld voor de studie van fysiologische en pathologische mechanismen die betrokken zijn bij luchtwegreactiviteit, longbehoud en preklinisch onderzoek bij longtransplantatie en longoedeem.
Abstract
Het geïsoleerde longperfusiesysteem is veel gebruikt in longonderzoek en draagt bij aan het ophelderen van de innerlijke werking van de longen, zowel micro- als macroscopisch. Deze techniek is nuttig bij de karakterisering van longfysiologie en pathologie door metabole activiteiten en ademhalingsfuncties te meten, inclusief interacties tussen circulerende stoffen en de effecten van geïnhaleerde of doordrenkte stoffen, zoals bij het testen van geneesmiddelen. Terwijl in vitro methoden het snijden en kweken van weefsels omvatten, maakt het geïsoleerde ex vivo longperfusiesysteem het mogelijk om te werken met een volledig functioneel orgaan dat de studie van een continue fysiologische functie mogelijk maakt terwijl ventilatie en perfusie worden gerecreëerd. Er moet echter worden opgemerkt dat de effecten van de afwezigheid van centrale innervatie en lymfedrainage nog steeds volledig moeten worden beoordeeld. Dit protocol heeft tot doel de assemblage van het geïsoleerde longapparaat te beschrijven, gevolgd door de chirurgische extractie en cannulatie van longen en hart van proefdieren, evenals om de perfusietechniek en signaalverwerking van gegevens weer te geven. De gemiddelde levensvatbaarheid van de geïsoleerde long varieert tussen 5-8 uur; tijdens deze periode neemt de pulmonale capillaire permeabiliteit toe, waardoor oedeem en longletsel ontstaan. De functionaliteit van geconserveerd longweefsel wordt gemeten aan de hand van de capillaire filtratiecoëfficiënt (Kfc), die wordt gebruikt om de mate van longoedeem door de tijd heen te bepalen.
Introduction
Brodie en Dixon beschreven het ex-vivo longperfusiesysteem voor het eerst in 1903 1. Sindsdien is het een gouden standaardinstrument geworden voor het bestuderen van de fysiologie, farmacologie, toxicologie en biochemie van de longen2,3. De techniek biedt een consistente en reproduceerbare manier om de levensvatbaarheid van longtransplantaties te evalueren en om het effect van ontstekingsmediatoren zoals histamine, arachidonzuurmetabolieten en stof P te bepalen, evenals hun interacties tijdens longverschijnselen zoals bronchoconstrictie, atelectase en longoedeem. Het geïsoleerde longsysteem is een belangrijke techniek geweest bij het onthullen van de belangrijke rol van de longen bij de eliminatie van biogene amines uit de algemene circulatie4,5. Daarnaast is het systeem gebruikt om de biochemie van pulmonale surfactant6 te evalueren. In de afgelopen decennia is het ex-vivo longperfusiesysteem uitgegroeid tot een ideaal platform voor longtransplantatieonderzoek7. In 2001 beschreef een team onder leiding van Stig Steen de eerste klinische toepassing van het ex-vivo longperfusiesysteem door het te gebruiken om de longen van een 19-jarige donor te reconditioneren, die aanvankelijk werd afgewezen door transplantatiecentra vanwege zijn verwondingen. De linkerlong werd geoogst en gedurende 65 minuten doordrenkt; daarna werd het met succes getransplanteerd in een 70-jarige man met COPD8. Verder onderzoek naar longreconditionering met behulp van de ex-vivo perfusie leidde tot de ontwikkeling van de Toronto-techniek voor verlengde longperfusie om gewonde donorlongen te beoordelen en te behandelen9,10. Klinisch gezien is gebleken dat het ex-vivo longperfusiesysteem een veilige strategie is om donorpools te vergroten door substandaard donorlongen te behandelen en te reconditioneren, zonder significant verschil in risico’s of uitkomsten ten opzichte van standaardcriteriadonoren10.
Het belangrijkste voordeel van het geïsoleerde longperfusiesysteem is dat de experimentele parameters kunnen worden geëvalueerd in een volledig functioneel orgaan dat zijn fysiologische functie behoudt onder een kunstmatige laboratoriumopstelling. Bovendien maakt het de meting en manipulatie van pulmonale mechanische ventilatie mogelijk om de componenten van de longfysiologie te analyseren, zoals luchtwegweerstand, totale vasculaire weerstand, gasuitwisseling en oedeemvorming, die tot op heden niet precies in vivo op proefdieren kunnen worden gemeten2. Met name de samenstelling van de oplossing waarmee de long wordt geperfuseerd, kan volledig worden gecontroleerd, waardoor de toevoeging van stoffen in realtime hun effecten kan evalueren en monsterverzameling uit perfusie voor verder onderzoek11. Onderzoekers die met het geïsoleerde longsysteem werken, moeten in gedachten houden dat mechanische ventilatie verval van het longweefsel veroorzaakt, waardoor de nuttige tijd wordt verkort. Deze progressieve daling van de mechanische parameters kan aanzienlijk worden vertraagd door de longen af en toe te hyperinflateren tijdens de tijd van het experiment4. Toch kan de voorbereiding meestal niet langer dan acht uur duren. Een andere overweging voor het ex-vivo longperfusiesysteem is de afwezigheid van regulatie van het centrale zenuwstelsel en lymfedrainage. De effecten van hun afwezigheid zijn nog niet volledig begrepen en kunnen mogelijk een bron van vooringenomenheid zijn in bepaalde experimenten.
De geïsoleerde longperfusiesysteemtechniek kan in het konijnenmodel worden uitgevoerd met een hoge mate van consistentie en reproduceerbaarheid. Dit werk beschrijft de technische en chirurgische procedures voor de implementatie van de ex-vivo geïsoleerde longperfusietechniek zoals ontwikkeld voor het konijnenmodel aan het Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias in Mexico-Stad, met de bedoeling de inzichten te delen en een duidelijke gids te bieden voor de belangrijkste stappen in de toepassing van dit experimentele model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk geeft een algemeen beeld van het geïsoleerde longperfusiesysteem, een essentiële techniek in longfysiologisch onderzoek. Het geïsoleerde longperfusiesysteem biedt een grote mate van veelzijdigheid in zijn toepassingen en maakt de evaluatie mogelijk van verschillende parameters die relevant zijn voor het testen van een breed scala aan hypothesen15. Een geïsoleerd longsysteem is een hulpmiddel met wereldwijde aanwezigheid dat in het afgelopen decennium zijn relevantie voor orgaanspecifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Ph.D. Bettina Sommer Cervantes bedanken voor haar steun bij het schrijven van dit manuscript, en Kitzia Elena Lara Safont voor haar steun bij de illustraties.
Materials
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1054-1062 (2014).
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D. Is perfusate exchange during. Annals of Translational Medicine. 8 (3), 43 (2020).
- Alquicira-Mireles, J. . Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. . Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE) Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021)
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
