Udvinding af Cofactor F420 til analyse af polyglutamat halelængde fra methanogenic rene kulturer og miljøprøver

Summary

En metode til udvinding af cofaktor _F420 fra rene kulturer blev optimeret til flydende kromatografisk adskillelse og analyse af _F420 halelængde i ren kultur og miljøprøver.

Abstract

Cofaktoren _F420 spiller en central rolle som hydridbærer i den primære og sekundære metabolisme hos mange bakterielle og arkæiske taxa. Cofaktoren er bedst kendt for sin rolle i methanogenese, hvor det letter termodynamisk vanskelige reaktioner. Da polyglutamat halen varierer i længde mellem forskellige organismer, kan længdeprofilanalyser være et kraftfuldt værktøj til at skelne og karakterisere forskellige grupper og veje i forskellige levesteder. Her beskriver protokollen udvindingen og optimeringen af cofaktor _{F420-påvisning} ved at anvende fastfaseudvinding kombineret med højtydende flydende kromatografianalyse uafhængigt af kulturelle eller molekylære biologiske tilgange. Metoden blev anvendt til at få yderligere oplysninger om cofaktor _F420’s udtryk fra mikrobielle samfund i jord, anaerobe slam og rene kulturer og blev evalueret ved spiking eksperimenter. Dermed lykkedes det undersøgelsen at generere forskellige _F420 halelængdeprofiler for hydrogenotrofisk og acetoclastic methanogener i kontrollerede methanogenic rene kulturer samt fra miljøprøver som anaerobe rådnetankslam og jord.

Introduction

_F420 er en udbredt, men ofte forsømt cofaktor, der fungerer som en obligatorisk to-elektronhydridbærer i primære og sekundære metaboliske processer i både Archaea og ^Bacteria1,2. _F420 er en 5-deazaflavin og strukturelt ligner flavins, hvorved dens kemiske og biologiske egenskaber er mere sammenlignelige med nad ⁺ eller NADP ⁺. På grund af substitution af kvælstof med kulstof ved position 5 i isoalloxazinringen er det et stærkt reduktant, hvilket udviser et lavt standard redox-potentiale på -340 ^mV1,3. _F420 består af en 5-deazaflavin ring og en 2-fosfo-L-laktat linker (_F420-0). En oligoglutamat hale, der indeholder n+1 glutamatmonomerer, kan fastgøres til molekylet (_F420-n+1)⁴.

I lang tid har cofaktoren _F420 udelukkende været forbundet med Archaea og Actinobacteria. Dette er stort set blevet væltet. Nylige analyser viste, at _F420 er fordelt på forskellige anerobe og aerobe organismer i phyla Proteobacteria, Chloroflexi, og potentielt Firmicutes beboer et utal af levesteder som jord, søer, og den menneskelige ^tarm1,5. I 2019 viste Braga et ^al.6, at proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica producerer et unikt _F420-derivat, der indeholder en 3-fosphoglycerate i stedet for en 2-fosfolactathale, som kan være udbredt i forskellige levesteder. Inden for domænet Archaea, _F420 er blevet fundet i flere slægter, herunder methanogenic7, methanotrofisk8,9, og sulfat-reducerende ^ordrer10, og formodes at være produceret i Thaumarchaeota11. _F420 er bedst kendt som et essentielt redox coenzym i hydrogenotrofisk og methylotrofisk methanogenese. Den reducerede form af _F420 (_F420H2) fungerer som elektrondonor til reduktion af methylentetrahydromethanopterin (methylen-H4MPT, Mer) og methenyl-H4MPT12,13. Det kan også bruges som en elektronbærer i _{H2-uafhængige} elektrontransportveje af methanogener, der indeholder cytochromes12,14. Desuden har den oxiderede form af _F420 en karakteristisk blågrøn fluorescens ved excitation ved 420 nm, hvilket letter påvisning af methanogener mikroskopisk (figur 1). På grund af det lave redoxpotentiale letter _F420 (i) den udefrakommende reduktion af et bredt spektrum af ellers genstridige eller giftige organiske forbindelser, ii) syntese af tetracyklin- og lincosamid antibiotika eller phytotoktoksin i streptomycetes (phylum Actinobacteria) og (iii) resistens over for oxidativ eller nitrosativ stress eller andre ugunstige tilstande i mycobacteria (phylum Actinobacteria)^1,5,15 16,17,18,19,20,21,22. Derfor er _{F420-afhængige} oxidoreductaser lovende biokatalysatorer til industrielle og farmaceutiske formål samt til biorensning af forurenede ^miljøer1,23. På trods af disse nylige resultater er de nøjagtige roller for cofaktoren _F420 stadig marginalt kendt i Actinobacteria eller anden bakteriel phyla.

Der er mindst tre veje til _F420 biosyntese2,6,24. I begyndelsen er biosyntesevejen opdelt i en 5-deazaflavin biosyntese og en 2-fosfolactat metabolismegren. Den reaktive del af _{F420-molekylet} syntetiseres via _FO-synthase ved hjælp af substraterne tyrosin og 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Resultatet er riboflavin niveau chromophore _FO. Inden for den aktuelt accepterede laktatmetabolismegren fosforyleres L-laktat til 2-fosfo-L-laktat af en L-laktatkinase (CofB); 2-fosfo-L-laktat, igen, er guanyleret til L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin ved 2-fosfo-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I næste trin er L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin forbundet med _FO ved en 2-fosfo-L-laktatoverførselase (CofD) til _F420-02. Endelig enzymet _F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligates glutamat monomers til _F420-0, danner den endelige ^cofaktor6 i varierende ^antal23,25. Forskellige organismer viser forskellige mønstre i antallet af tilknyttede glutamatrester, med kortere haler fundet for methanogener end i mycobacteria2,25,26. Generelt viser methanogener halelængder fra to til tre, med op til fem i acetoclastic methanogen, Methanosarcina sp., mens halelængder fundet i Mycobacterium sp. varierede fra fem til syv glutamatrester2,25,26,27. De seneste resultater viste imidlertid, at _F420 med lang kæde binder sig til _{F420-afhængige} oxidoreductaser med en højere affinitet end kortkædet _F420; Desuden øger bundne langkædede _F420 substrataffiniteten, men reducerer omsætningen af de respektive ^enzymer23.

Påvisning af cofaktor _F420 er ofte baseret på dens fluorescens. Derved blev dens oligo glutamat derivater adskilt ved hjælp af omvendt fase (RP)-^HPLC27,28. For nylig brugte Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxid som et ionparringsreagens til den negativt ladede glutamathale for at forbedre adskillelsen på RP-HLPC med ^succes5. Her præsenterer vi en metode til fremstilling af prøver, efterfølgende lysis, udvinding, rensning, adskillelse og kvantificering af cofaktor _F420 ikke kun fra rene kulturer, men også fra forskellige miljøprøver (dvs. jord og rådnende slam).

Protocol

BEMÆRK: Udvinding og analyse af cofaktor F420 er en tretrinsproces, herunder prøve lysis, cofaktorforrensning via solid-fase ekstraktion (SPE) og cofaktordetektering via ion-parret-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) med fluorescensdetektering. Inden du begynder, skal materialerne og reagenserne klargøres som angivet i tabel 1. 1. Prøve lysis Der tilsættes op til 5 g prøve til passende rør (f.eks. 50 mL koniske rør). 5 gtL af lysisbufferen (2x lageropl?…

Representative Results

Rene kulturer af Methanosarcina thermophila og Methanoculleus thermophilus, begge termofile methanogenic Archaea, blev dyrket i egnede medier som beskrevet tidligere29,30. For Methanosarcina thermophila blev methanol brugt som energikilde, mens Methanoculleus thermophilus blev dyrket på H2/CO2. Væksten blev kontrolleret ved mikroskopisk evaluering, mens aktiviteten blev undersøgt ved måling af…

Discussion

Til evaluering af cofaktor _F420 fra methanogenic rene kulturer kan der udføres en mikroskopisk evaluering for at visualisere væksten og aktiviteten (fluorescensmikroskopi) af de involverede mikroorganismer (figur 1). For prøver, der stammer fra naturlige miljøer, er brugen af mikroskopi til at detektere eller kvantificere _F420 begrænset på grund af interferens med andre fluorescerende mikroorganismer, organiske og uorganiske partikler. I denne forbindelse kan ekst…

Materials

Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer