メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子F420 の抽出
Summary
純粋な培養物から補因子F420 を抽出する方法を、純粋培養および環境試料におけるF420 尾長の液体クロマトグラフィー分離および分析に最適化した。
Abstract
補因子F420 は、多くの細菌および古細菌分類の一次および二次代謝における水素化物担体としての中心的な役割を果たす。補因子は、熱力学的に困難な反応を促進する、温記生成におけるその役割で最もよく知られている。ポリグルタミン酸尾翼は生物間で長さが異なるため、長さプロファイル解析は、様々な生息地で異なるグループや経路を区別し、特徴付けるための強力なツールとなる可能性があります。ここで、プロトコルは、文化的または分子生物学的アプローチに依存しない高性能液体クロマトグラフィー分析と組み合わせた固相抽出を適用することによって補因子F420 検出の抽出および最適化について説明する。この方法は、土壌中の微生物群集、嫌気性汚泥、純粋な培養物から補因子F420 の発現に関する追加情報を得るために適用され、スパイク実験によって評価された。それにより、制御されたタンパク質原性純粋培養物、嫌気性消化剤汚泥や土壌などの環境試料から、水素栄養学およびアセトクラス系のメタノゲンに対する異なるF420 尾長プロファイルの生成に成功した。
Introduction
F420は、広く普及しているが、しばしば無視された補因子であり、これは、古細菌および細菌1,2の両方の一次および二次代謝プロセスにおける義務的な2電子水素化物担体として機能する。F420は5-デアザフラビンであり、構造的にはフラビンに類似しており、それによってその化学的および生物学的特性はNAD+またはNADP+のものとより同等である。イソロキサジン環の位置5で窒素と炭素を置換するため、それは強力な還元剤であり、したがって-340 mV1,3の低標準酸化還元電位を示す。F420は、5-デアザフラビン環と2-ホスホ-L-乳酸リンカーを含む(F420-0)。n+1グルタミン酸モノマーを含むオリゴグルタミン酸尾を分子に結合させることができる(F420-n+1)4。
長い間、補因子F420は、単に古細菌とアクチノバクテリアと関連付けられてきた。これは主に覆されています。最近の分析では、F420はフィラプロテオバクテリア、クロロルレクシの多様な嫌気性および好気性生物の間に分布し、土壌、湖、人間の腸のような無数の生息地に生息する可能性のあるフィルミキュートが明らかになりました1,5.2019年、Bragaら.6は、プロテオバクテリウムパラブルクホルデリア・リゾキシニカが、様々な生息地で広まっている可能性のある2-ホスホラクテート尾の代わりに3-ホスホグリセリン酸を含むユニークなF420誘導体を産生することを示した。ドメインアルカエアの中で、F420は、メタノジェニック7、メトトロピー8、9、硫酸還元オーダー10を含むいくつかの系統で発見されており、タウマルカエオタ11で生産されることになっている。F420は、水素栄養学およびメチロトローフ性メタン新生において必須のレドックス補酵素として最もよく知られている。F420(F420H2)の還元形態は、メチレンネテトラヒドロメタノプテリン(メチレン-H4MPT、Mer)およびメテニルH4MPT12,13の還元のための電子ドナーとして機能する。また、シトクロム12,14を含有するメタノゲンのH2非依存性電子輸送経路における電子担体として用いることができる。さらに、F420の酸化型は、420nmでの励起時に特徴的な青色・緑色蛍光を有し、微小微小の微小化した微量体原の検出を容易にする(図1)。その低い酸化還元電位のために、F420は(i)それ以外の場合は再カルシタントまたは有毒な有機化合物の広いスペクトルの外因性減少を促進し、 (ii)ストレプトマイセテ(フィラムアクチノバクテリア)におけるテトラサイクリンおよびリンコサミド抗生物質またはフィトトキシンの合成、および(iii)抗酸菌(フィラムアクチノバクテリア)における酸化またはニトロ化ストレスまたはその他の不利な状態に対する耐性、 16,17,18,19,20,21,22.その結果、F420依存性酸化還元酵素は、工業および製薬の目的および汚染された環境のバイオレメディエーションのための有望な生体触媒である1,23。これらの最近の知見にもかかわらず、補因子F420の正確な役割は、アクシノバクテリアまたは他の細菌フィラでまだわずかに知られている。
F420生合成には少なくとも3つの経路があります2,6,24。初めに、生合成経路は5-デアザフラビン生合成および2-ホスホラク酸代謝分岐に分割される。F420分子の反応性部分は、フィロシンと5-アミノ-6-リビチルアミノ-2,4(1H, 3H)-ピリミジンジオンの基質を用いてFO-シンターゼを介して合成される。結果はリボフラビンレベルのクロモフォアFOです。現在受け入れられている乳酸代謝ブランチ内では、L-乳酸はL-乳酸キナーゼ(CofB)によって2-ホスホ-L-乳酸にリン酸化される。2-ホスホ-L-乳酸は、今度は、2-ホスホ-L-乳酸グアニリルトランスファーゼ(CofC)によってL-ラクチル-2-ジホスホ-5′-グアノシンにグアニル化される。次のステップでは、L-ラクチル-2-ジホスホ-5′-グアノシンは、F420-02を形成する2-ホスホ-L-乳酸トランスファーゼ(CofD)によってFOにリンクされています。最後に、酵素F420-0:ɣグルタミルリガーゼ(CofE)はグルタミン酸モノマーをF420-0にリゲートし、異なる数23,25で最終的な補因子6を形成する。異なる生物は、ミコバクテリア2,25,26よりも安価な尾がメサノゲンに見られる短い尾で、付着したグルタミン酸残基の数で異なるパターンを示す。一般的に、メタノゲンは2から3までの尾の長さを示し、アセトクラス性メタノゲン、メサノサルシナsp.で最大5つ、マイコバクテリウムspに見られる尾長は5〜7個のグルタミン酸残基2,25,26,27の範囲でした。しかし、最近の知見では、長鎖F420が短鎖F420よりも高い親和性を有するF420依存性オキシド還元酵素に結合することが示された。また、結合長鎖F420は基質親和性を高めるが、それぞれの酵素23の回転率を低下させる。
補因子F420の検出は、多くの場合、その蛍光に基づいています。それにより、そのオリゴグルタミン酸誘導体を逆相(RP)-HPLC27,28を用いて分離した。最近、Ney et al. は、負に荷電したグルタミン酸尾のイオン対向試薬として水酸化テトラブチラモニウムを使用し、RP-HLPC上での分離を正常に促進した5。ここでは、純粋な培養物からだけでなく、異なる環境サンプル(土壌および消化剤汚泥)からの補因子F420のサンプル、その後のリシス、抽出、精製、分離、定量の調製方法を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
微量原性純粋培養物からの補因子F420 の評価のために、関係する微生物の増殖および活性(蛍光顕微鏡)を可視化する顕微鏡評価を行うことができる(図1)。自然環境から派生したサンプルについては、F420 を検出または定量するための顕微鏡検査の使用は、他の蛍光微生物、有機および無機粒子との干渉のために制限されます。この文脈では、F420 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
コリン・ジャクソン教授の精製補因子F420のサポートに感謝します。この研究は、チロル科学基金(TWF)とインスブルック大学(プブリケーションズフォンズ)によって支援されました。我々は、GPS、HK、SB、GG、およびHBのサポートを大いに認識しています。
Materials
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
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