Extraction du cofacteur F420 pour l’analyse de la longueur de la queue du polyglutamate à partir de cultures pures méthanogènes et d’échantillons environnementaux

Summary

Une méthode d’extraction du cofacteur _F420 à partir de cultures pures a été optimisée pour la séparation chromatographique liquide et l’analyse de la longueur de la queue _F420 dans des échantillons de culture pure et d’environnement.

Abstract

Le cofacteur _F420 joue un rôle central en tant que porteur d’hydrure dans le métabolisme primaire et secondaire de nombreux taxons bactériens et archéaux. Le cofacteur est surtout connu pour son rôle dans la méthanogenèse, où il facilite les réactions thermodynamiquement difficiles. Comme la longueur de la queue de polyglutamate varie d’un organisme à l’autre, les analyses de profil de longueur pourraient être un outil puissant pour distinguer et caractériser différents groupes et voies dans divers habitats. Ici, le protocole décrit l’extraction et l’optimisation de la détection du cofacteur _F420 en appliquant l’extraction en phase solide combinée à une analyse par chromatographie liquide à haute performance indépendante des approches culturelles ou biologiques moléculaires. La méthode a été appliquée pour obtenir des informations supplémentaires sur l’expression du cofacteur _F420 à partir de communautés microbiennes dans les sols, les boues anaérobies et les cultures pures et a été évaluée par des expériences de pic. Ainsi, l’étude a réussi à générer différents profils de longueur de queue _F420 pour les méthanogènes hydrogénotrophes et acétoclastiques dans des cultures pures méthanogènes contrôlées ainsi qu’à partir d’échantillons environnementaux tels que les boues et les sols de digesteurs anaérobies.

Introduction

_F420 est un cofacteur répandu mais souvent négligé, qui fonctionne comme un transporteur d’hydrure à deux électrons obligatoire dans les processus métaboliques primaires et secondaires des archées et des bactéries1,2. _F420 est une 5-déazaflavine et structurellement similaire aux flavines, ses propriétés chimiques et biologiques étant plus comparables à celles du NAD⁺ ou du NADP⁺. En raison de la substitution de l’azote par du carbone à la position 5 du cycle isoalloxazine, il s’agit d’un puissant réducteur, présentant ainsi un faible potentiel redox standard de -340 ^mV1,3. _F420 comprend un cycle de 5-déazaflavine et un liant 2-phospho-L-lactate (_F420-0). Une queue d’oligoglutamate contenant n+1 monomères de glutamate peut être attachée à la molécule (_F420-n+1)⁴.

Pendant longtemps, le cofacteur _F420 a été uniquement associé aux archées et aux actinobactéries. Cela a été largement renversé. Des analyses récentes ont révélé que le _F420 est réparti entre divers organismes anaérobies et aérobies des phyla Proteobacteria, Chloroflexi, et potentiellement Firmicutes habitant une myriade d’habitats comme les sols, les lacs et l’intestin ^humain1,5. En 2019, Braga et ^al.6, ont montré que la protéobactérie Paraburkholderia rhizoxinica produit un dérivé unique de _F420, contenant un 3-phosphoglycérate au lieu d’une queue de 2-phospholactate, qui pourrait être répandu dans divers habitats. Dans le domaine Archaea, _F420 a été trouvé dans plusieurs lignées, y compris methanogenic7, methanotrophic8,9 et sulfate-reducing ^orders10, et est censé être produit dans Thaumarchaeota11. _F420 est surtout connu comme une coenzyme redox essentielle dans la méthanogenèse hydrogénotrophe et méthylotrophique. La forme réduite de _F420 (_F420H2) fonctionne comme un donneur d’électrons pour la réduction de la méthylènetétrahydrométhanoptérine (méthylène-H4MPT, Mer) et du méthényl-H4MPT12,13. Il peut également être utilisé comme transporteur d’électrons dans les voies de transport d’électrons indépendantes de _H2 de méthanogènes contenant des ^{cytochromes12,14}. De plus, la forme oxydée de _F420 a une fluorescence bleu-vert caractéristique lors de l’excitation à 420 nm, ce qui facilite la détection microscopique des méthanogènes (Figure 1). En raison de son faible potentiel redox, _F420 facilite (i) la réduction exogène d’un large spectre de composés organiques autrement récalcitrants ou toxiques, (ii) la synthèse d’antibiotiques tétracycline et de lincosamide ou de phytotoxines chez les streptomycètes (phylum Actinobacteria), et (iii) la résistance au stress oxydatif ou nitrosatif ou à d’autres conditions défavorables chez les mycobactéries (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Par conséquent, les oxydoréductases dépendantes de la _F420 sont des biocatalyseurs prometteurs à des fins industrielles et pharmaceutiques ainsi que pour la bioremédiation des environnements ^{contaminés1,23}. Malgré ces découvertes récentes, les rôles exacts du cofacteur _F420 sont encore marginalement connus chez les Actinobactéries ou d’autres phyla bactériens.

Il existe au moins trois voies pour la biosynthèse _F4202,6,24. Au début, la voie de biosynthèse est divisée en une biosynthèse de la 5-déazaflavine et une branche du métabolisme du 2-phospholactate. La partie réactive de la molécule _F420 est synthétisée via la _FO-synthase en utilisant les substrats tyrosine et 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione. Le résultat est le niveau de riboflavine chromophore _FO. Dans la branche du métabolisme du lactate actuellement acceptée, le L-lactate est phosphorylé en 2-phospho-L-lactate par une L-lactate kinase (CofB); Le 2-phospho-L-lactate, à son tour, est guanylé en L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine par la 2-phospho-L-lactate guanylyltransférase (CofC). Dans l’étape suivante, la L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosine est liée à la _FO par une 2-phospho-L-lactate transférase (CofD) pour former _F420-02. Enfin, l’enzyme _F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) ligate les monomères du glutamate en _F420-0, formant le cofacteur ^final6 en nombre ^{variable23,25}. Différents organismes présentent des modèles différents dans le nombre de résidus de glutamate attachés, avec des queues plus courtes trouvées pour les méthanogènes que dans les mycobactéries2,25,26. Généralement, les méthanogènes montrent des longueurs de queue de deux à trois, avec jusqu’à cinq dans le méthanogène acétoclastique, Methanosarcina sp., tandis que les longueurs de queue trouvées dans Mycobacterium sp. variaient de cinq à sept résidus de glutamate2,25,26,27. Cependant, des résultats récents ont montré que la _F420 à longue chaîne se lie aux oxydoréductases dépendantes de la _F420 avec une affinité plus élevée que la _F420 à chaîne courte; de plus, la _F420 à longue chaîne liée augmente l’affinité du substrat mais diminue le taux de renouvellement des enzymes ^{respectives23}.

La détection du cofacteur _F420 est souvent basée sur sa fluorescence. Ainsi, ses dérivés oligo-glutamate ont été séparés à l’aide de la phase inversée (RP)-^HPLC27,28. Récemment, Ney et al. ont utilisé l’hydroxyde de tétrabutylammonium comme réactif d’appariement d’ions pour la queue de glutamate chargée négativement afin d’améliorer la séparation sur RP-HLPC avec ^succès5. Nous présentons ici une méthode pour la préparation d’échantillons, la lyse ultérieure, l’extraction, la purification, la séparation et la quantification du cofacteur _F420 non seulement à partir de cultures pures, mais également à partir de différents échantillons environnementaux (sols et boues de digesteur).

Protocol

REMARQUE: L’extraction et l’analyse du cofacteur F420 est un processus en trois étapes comprenant la lyse de l’échantillon, la pré-purification du cofacteur via l’extraction en phase solide (SPE) et la détection des cofacteurs via IP-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) avec détection de fluorescence. Avant de commencer, préparez les matériaux et les réactifs comme indiqué dans le tableau 1. 1. Lyse de l’échantillon Ajouter jusqu’à 5 g d’échantil…

Representative Results

Des cultures pures de Methanosarcina thermophila et de Methanoculleus thermophilus, deux archées méthanogènes thermophiles, ont été cultivées dans des milieux appropriés comme décrit précédemment29,30. Pour Methanosarcina thermophila, le méthanol a été utilisé comme source d’énergie, tandis que Methanoculleus thermophilus a été cultivé sur H2/CO2. La croissance a été vérifi?…

Discussion

Pour l’évaluation du cofacteur _F420 à partir de cultures pures méthanogènes, une évaluation microscopique peut être effectuée pour visualiser la croissance et l’activité (microscopie à fluorescence) des micro-organismes impliqués (Figure 1). Pour les échantillons provenant d’environnements naturels, l’utilisation de la microscopie pour détecter ou quantifier _F420 est limitée en raison des interférences avec d’autres micro-organismes fluorescents,…

Materials

Autoclave
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector	Shimadzu		HPLC system
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm	Phenomenex		HPLC column
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent	Phenomenex		weak anion mixed-mode polymeric sorbent
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes			SPE equipment
Vortex mixer