En metode for utvinning av kofaktor F420 fra rene kulturer ble optimalisert for flytende kromatografisk separasjon og analyse av F420 hale lengde i ren kultur og miljøprøver.
Cofactor F420 spiller en sentral rolle som hydridbærer i den primære og sekundære metabolismen av mange bakterielle og arkaeale taxa. Kofaktoren er mest kjent for sin rolle i metanogenese, hvor det letter termodynamisk vanskelige reaksjoner. Ettersom den polyglutamat hale varierer i lengde mellom ulike organismer, lengde profil analyser kan være et kraftig verktøy for å skille og karakterisere ulike grupper og veier i ulike habitater. Her beskriver protokollen utvinning og optimalisering av kofaktor F420-deteksjon ved å bruke fastfaseutvinning kombinert med høyytelses væskekromatografianalyse uavhengig av kulturelle eller molekylære biologiske tilnærminger. Metoden ble brukt for å få ytterligere informasjon om uttrykket av cofactor F420 fra mikrobielle samfunn i jord, anaerob slam og rene kulturer og ble evaluert ved spiking eksperimenter. Dermed lyktes studien i å generere forskjellige F420 halelengdeprofiler for hydrogenotrofiske og acetoklastiske metanogener i kontrollerte metanogene rene kulturer, så vel som fra miljøprøver som anaerob fordøyelsesslam og jord.
F420 er en utbredt, men ofte forsømt kofaktor, som fungerer som en obligatorisk to-elektronhydridbærer i primære og sekundære metabolske prosesser av både Arkaea og Bakterier1,2. F420 er en 5-deazaflavin og strukturelt lik flavins, hvorved dens kjemiske og biologiske egenskaper er mer sammenlignbare med de av NAD + eller NADP +. På grunn av substitusjon av nitrogen med karbon i posisjon 5 av isoalloksazinen, er det et sterkt reduktant, og viser dermed et lavt standard redokspotensial på -340 mV1,3. F420 består av en 5-deazaflavin ring og en 2-fosfo-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamathale som inneholder n +1 glutamatmonomerer kan festes til molekylet (F420-n+1)4.
I lang tid har cofactor F420 vært utelukkende forbundet med Archaea og Actinobacteria. Dette har i stor grad blitt veltet. Nyere analyser viste at F420 er fordelt på forskjellige anaerobe og aerobe organismer av phyla Proteobacteria, Chloroflexi, og potensielt Firmicutes som bor i et utall habitater som jord, innsjøer og den menneskelige tarmen1,5. I 2019 viste Braga et al.6 at proteobakterien Paraburkholderia rhizoxinica produserer et unikt F420-derivat, som inneholder et 3-fosfoglyserat i stedet for en 2-phospholactate hale, som kan være utbredt i ulike habitater. Innenfor domenet Archaea har F420 blitt funnet i flere avstamninger, inkludert methanogenic7, methanotrophic8,9, og sulfatreduserende ordrer10, og skal produseres i Thaumarchaeota11. F420 er best kjent som et essensielt redoks koenzym i hydrogenotrofisk og metytrofisk metanogenese. Den reduserte formen for F420 (F420H2) fungerer som elektrondonor for reduksjon av metylentrahydromethanopterin (metylen-H4MPT, Mer) og methenyl-H4MPT12,13. Den kan også brukes som elektronbærer i H2-uavhengige elektrontransportveier av metanogener som inneholder cytokromer12,14. Videre har den oksiderte formen av F420 en karakteristisk blågrønn fluorescens ved eksitasjon ved 420 nm, noe som letter påvisning av metanogener mikroskopisk (figur 1). På grunn av sitt lave redokspotensial letter F420 (i) den eksogene reduksjonen av et bredt spekter av ellers tilbakevendende eller giftige organiske forbindelser, (ii) syntese av tetracyklin og lincosamid antibiotika eller fytotoksiner i streptomycetes (phylum Actinobacteria), og (iii) resistens mot oksidativt eller nitrosativt stress eller andre ugunstige forhold i mykobakterier (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Følgelig er F420-avhengige oksidoreductaser lovende biokakalysatorer for industrielle og farmasøytiske formål, samt for bioremediering av forurensede miljøer1,23. Til tross for disse nylige funnene er de eksakte rollene til kofaktoren F420 fortsatt marginalt kjent i Actinobacteria eller annen bakteriell phyla.
Det er minst tre veier for F420 biosyntese2,6,24. I begynnelsen er biosyntesebanen delt inn i en 5-deazaflavin biosyntese og en 2-phospholactate metabolisme gren. Den reaktive delen av F420-molekylet syntetiseres via FO-syntase ved hjelp av substratene tyrosin og 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidindione. Resultatet er riboflavin nivå kromofor FO. Innenfor den nåværende aksepterte laktatmetabolismegrenen er L-laktat fosforylert til 2-fosfo-L-laktat av en L-laktatkinase (CofB); 2-fosfo-L-laktat, i sin tur, er guanylated til L-laktyl-2-difosfo-5′-guanosin med 2-fosfo-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I neste trinn er L-laktyl-2-difosfo-5′-guanosin knyttet til FO med en 2-fosfo-L-laktat transferase (CofD) for å danne F420-02. Til slutt ligater enzymet F420-0:ɣ-glutamyl ligase (CofE) glutamatmonomerer til F420-0, og danner den endelige cofactor6 i varierende tall23,25. Ulike organismer viser forskjellige mønstre i antall vedlagte glutamatrester, med kortere haler funnet for metanogener enn i mykobakterier2,25,26. Generelt viser metanogener hale lengder fra to til tre, med opptil fem i acetoklastisk methanogen, Methanosarcina sp., mens hale lengder funnet i Mycobacterium sp. varierte fra fem til syv glutamatrester2,25,26,27. Nyere funn viste imidlertid at langkjedet F420 binder seg til F420-avhengige oksidoreductaser med høyere affinitet enn kortkjedet F420; Videre øker bundet langkjedet F420 substrataffiniteten, men reduserer omsetningshastigheten til respektive enzymer23.
Påvisning av cofactor F420 er ofte basert på fluorescens. Dermed ble dens oligo glutamatavledninger skilt ved hjelp av omvendt fase (RP)-HPLC27,28. Nylig brukte Ney et al. tetrabutylammoniumhydroksid som et ionparerende reagens for den negativt ladede glutamathalen for å forbedre separasjonen på RP-HLPC vellykket5. Her presenterer vi en metode for fremstilling av prøver, etterfølgende lysis, ekstraksjon, rensing, separasjon og kvantifisering av cofactor F420, ikke bare fra rene kulturer, men også fra forskjellige miljøprøver (dvs. jord og fordøyelsesslam).
For evaluering av cofactor F420 fra metanogene rene kulturer kan det utføres en mikroskopisk evaluering for å visualisere veksten og aktiviteten (fluorescensmikroskopi) av de involverte mikroorganismer (figur 1). For prøver som stammer fra naturlige miljøer, er bruken av mikroskopi for å oppdage eller kvantifisere F420 begrenset på grunn av forstyrrelser med andre fluorescerende mikroorganismer, organiske og uorganiske partikler. I denne sammenhengen kan utvinning…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker takknemlig prof. Colin Jackson for støtten med renset medfaktor F420. Denne forskningen ble støttet av Tyrolsk vitenskapsfond (TWF) og Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi anerkjenner i stor grad støtten fra GPS, HK, SB, GG og HB.
Autoclave | |||
Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
Vortex mixer |