Extraktion av Cofactor F420 för analys av polyglutamate svanslängd från methanogenic rena kulturer och miljöprover
Summary
En metod för utvinning av kofaktor F420 från rena kulturer optimerades för vätskekromatografisk separation och analys av F420 svanslängd i rena odlings- och miljöprover.
Abstract
Kofaktorn F420 spelar en central roll som hydridbärare i den primära och sekundära metabolismen av många bakteriella och ålderdomliga taxa. Kofaktorn är mest känd för sin roll i metanogenes, där den underlättar termodynamiskt svåra reaktioner. Eftersom polyglutamate svansen varierar i längd mellan olika organismer, kan längdprofilanalyser vara ett kraftfullt verktyg för att skilja och karakterisera olika grupper och vägar i olika livsmiljöer. Här beskriver protokollet extraktion och optimering av kofaktor F420 detektion genom att tillämpa solid fas extraktion i kombination med högpresterande vätskekromatografi analys oberoende av kulturella eller molekylära biologiska metoder. Metoden tillämpades för att få ytterligare information om uttrycket av kofaktor F420 från mikrobiella samhällen i jordar, anaeroba slam och rena kulturer och utvärderades genom spikningsexperiment. Därmed lyckades studien generera olika F420 svanslängdsprofiler för hydrogenotrofiska och acetoclasta metanogener i kontrollerade metanogena rena kulturer samt från miljöprover som anaerobt rötslam och jordar.
Introduction
F420 är en utbredd men ofta försummad kofaktor, som fungerar som en obligatorisk tvåelektronhydridbärare i primära och sekundära metaboliska processer av både Arkéer och Bakterier1,2. F420 är en 5-deazaflavin och strukturellt lik flavins, varigenom dess kemiska och biologiska egenskaper är mer jämförbara med NAD + eller NADP +. På grund av substitutionen av kväve med kol vid position 5 i isoalloxazinringen är det ett starkt reduktant, vilket uppvisar en låg standard redox potential på -340 mV1,3. F420 består av en 5-deazaflavin ring och en 2-phospho-L-laktat linker (F420-0). En oligoglutamat svans som innehåller n +1 glutamat monomerer kan fästas på molekylen (F420-n+1)4.
Under lång tid har kofaktorn F420 endast associerats med Archaea och Actinobacteria. Detta har till stor del omkullkastats. Nyligen genomförda analyser visade att F420 distribueras mellan olika anaeroba och aeroba organismer av phyla Proteobacteria, Chloroflexi och potentiellt Firmicutes som bor i en myriad av livsmiljöer som jordar, sjöar och den mänskliga tarmen1,5. År 2019 visade Braga et al.6 att proteobakterien Paraburkholderia rhizoxinica producerar ett unikt F420-derivat, innehållande ett 3-fosfosfolat istället för en 2-phossfolactate svans, som kan vara utbredd i olika livsmiljöer. Inom området Archaea har F420 hittats i flera härstamningar, inklusive mekanogen7, methanotrofisk8,9 och sulfatreducerande order10, och är tänkt att produceras i Thaumarchaeota11. F420 är mest känd som en viktig redox coenzyme i hydrogenotrofisk och metotrofisk metanogenes. Den reducerade formen av F420 (F420H2) fungerar som elektrondonator för minskning av metylenetrahydrometanopterin (metylen-H4MPT, Mer) och methenyl-H4MPT12,13. Det kan också användas som elektronbärare i H2-oberoende elektrontransportvägar för metanogener som innehåller cytokromer12,14. Dessutom har den oxiderade formen av F420 en karakteristisk blågrön fluorescens vid excitation vid 420 nm, vilket underlättar detektion av metanogener mikroskopiskt (figur 1). På grund av sin låga redoxpotential underlättar F420 i) den exogena minskningen av ett brett spektrum av annars motsträviga eller giftiga organiska föreningar, ii) syntes av tetracyklin- och linkosamidantibiotika eller fytotoxiner i streptomyceter (fylum Actinobacteria) och iii) resistens mot oxidativ eller nitrosativ stress eller andra ogynnsamma förhållanden i mykobakterier (fylum Actinobacteria)1,5, 16,17,18,19,20,21,22. Följaktligen är F420-beroende oxidoreduktaser lovande biokatalysanter för industriella och farmaceutiska ändamål samt för bioremediation av förorenade miljöer1,23. Trots dessa senaste resultat är de exakta rollerna för kofaktorn F420 fortfarande marginellt kända i Actinobacteria eller annan bakteriell phyla.
Det finns minst tre vägar för F420 biosyntes2,6,24. I början delas biosyntesvägen upp i en 5-deazaflavin biosyntes och en 2-fosfolactate metabolism gren. Den reaktiva delen av F420-molekylen syntetiseras via FO-syntas med hjälp av substraten tyrosin och 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedion. Resultatet är riboflavin nivå kromofor FO. Inom den för närvarande accepterade laktatmetabolismgrenen fosforyleras L-laktat till 2-fosfato-L-laktat av en L-laktatkinas (CofB); 2-fosfatfos-L-laktat, i sin tur, är guanylerad till L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin av 2-phospho-L-laktat guanylyltransferase (CofC). I nästa steg är L-lactyl-2-diphospho-5′-guanosin kopplad till FO genom en 2-phospho-L-laktattransferas (CofD) för att bilda F420-02. Slutligen ligates enzymet F420-0:ķ-glutamyl ligase (CofE) glutamatmonomerer till F420-0 och bildar den slutliga kofaktorn6 i varierande antal23,25. Olika organismer uppvisar olika mönster i antalet bifogade glutamatrester, med kortare svansar som finns för metanogener än i mykobakterier2,25,26. I allmänhet visar metanogener svanslängder från två till tre, med upp till fem i acetoclastic methanogen, Methanosarcina sp., medan svanslängder som finns i Mycobacterium sp. varierade från fem till sju glutamatrester2,25,26,27. De senaste resultaten visade dock att långkedjiga F420 binder till F420-beroende oxidoreduktaser med högre affinitet än kortkedjiga F420. Dessutom ökar den bundna långkedjiga F420 substrattillhörigheten men minskar omsättningshastigheten för respektive enzymer23.
Detektion av kofaktor F420 baseras ofta på dess fluorescens. Därmed separerades dess oligo glutamat derivat med hjälp av omvänd fas (RP)-HPLC27,28. Nyligen använde Ney et al. tetrabutylammoniumhydroxid som ett jonparningsreagens för den negativt laddade glutamat svansen för att förbättra separationen på RP-HLPC framgångsrikt5. Här presenterar vi en metod för beredning av prover, efterföljande lys, extraktion, rening, separation och kvantifiering av kofaktor F420 inte bara från rena kulturer utan också från olika miljöprover (dvs. jordar och rötslam).
Protocol
Representative Results
Discussion
För utvärdering av kofaktor F420 från methanogenic rena kulturer kan en mikroskopisk utvärdering utföras för att visualisera tillväxt och aktivitet (fluorescensmikroskopi) av de berörda mikroorganismerna (figur 1). För prover som härrör från naturliga miljöer är användningen av mikroskopi för att detektera eller kvantifiera F420 begränsad på grund av störningar med andra fluorescerande mikroorganismer, organiska och oorganiska partiklar. I detta samma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar tacksamt prof. Colin Jackson för stödet med renad kofaktor F420. Denna forskning stöddes av Tyrolska vetenskapsfonden (TWF) och Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Vi är mycket medvetna om stödet från GPS, HK, SB, GG och HB.
Materials
| Autoclave | |||
| Biocompatible HPLC system equipped with gradient modul, oven and fluorescence detector | Shimadzu | HPLC system | |
| Centrifuge and rotor for 50 mL “Falcon” tubes (11.000 rcf) and appropriate tubes | |||
| HPLC Column: Gemini NX C18, 5 μm, 150 x 3 mm | Phenomenex | HPLC column | |
| PTFE filter (pore size 0.22 µm) to remove particulate matter prior HPLC analysis | |||
| Resin for SPE: Strata-X-AW 33 μm as weak anion mixed-mode polymeric sorbent | Phenomenex | weak anion mixed-mode polymeric sorbent | |
| Vacuum manifold for SPE and appropriate collection tubes | SPE equipment | ||
| Vortex mixer |
References
- Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).
- Bashiri, G., et al. A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes. Nature Communications. 10 (1), 451 (2019).
- Grinter, R., Greening, C. Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. , (2021).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium. Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).
- Ney, B., et al. The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria. The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).
- Braga, D., et al. Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420. ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).
- Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments. Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).
- Michaelis, W., et al. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).
- Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps. Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).
- Lin, X. -. L., White, R. H. Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria. Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).
- Spang, A., et al. The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations. Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).
- Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).
- Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).
- Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri. mBio. 9 (4), (2018).
- Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea. FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).
- Purwantini, E., Daniels, L. Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).
- McCormick, J. R. D., Morton, G. O. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species. Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).
- Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -. S. T., Yurek, D. A. Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis. The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).
- Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase. Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).
- Gurumurthy, M., et al. A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).
- Greening, C., et al. Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism. Frontiers in Microbiology. 8, 1000 (2017).
- Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -. T., Fraaije, M. W. Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes. Chemical Communications. 54 (79), 11208-11211 (2018).
- Ney, B., et al. Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases. Frontiers in Microbiology. 8, 1902 (2017).
- Grinter, R., et al. Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria. mSystems. 5 (3), (2020).
- Peck, M. W. Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei. Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).
- Gorris, L. G., vander Drift, C. Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed. BioFactors. 4 (3-4), 139-145 (1994).
- Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species. Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).
- Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain). Microbial Ecology. 61, (2011).
- Wagner, A. O., et al. Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155 (2019).
- Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
- Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
- Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
- Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis. PloS one. 5 (12), 15803 (2010).
