通过恶性周围神经鞘肿瘤细胞中絮状等位基因的 离体 消融来定义肿瘤发生的基因功能
Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于在基因工程小鼠模型衍生 的肿瘤中 执行胚胎在体内致命的基因敲除，然后评估敲除对肿瘤生长，增殖，存活，迁移，侵袭以及 体外 和 体内转录组的影响。
Abstract
精确靶向人类癌症中关键蛋白质的新药的开发正在从根本上改变癌症治疗方法。然而，在使用这些药物之前，它们的靶蛋白必须被验证为特定癌症类型的治疗靶点。这种验证通常是通过在癌症的基因工程小鼠（GEM）模型中敲除编码候选治疗靶标的基因并确定其对肿瘤生长的影响来进行的。不幸的是，诸如传统淘汰赛中的胚胎杀伤力和有条件淘汰赛中的镶嵌性等技术问题经常限制这种方法。为了克服这些限制，开发了一种在GEM模型中产生的恶性周围神经鞘肿瘤（MPNSTs）短期培养物中烧蚀的未光斑胚胎致死性目的基因的方法。
本文描述了如何建立具有适当基因型的小鼠模型，从这些动物中提取短期肿瘤培养物，然后使用表达Cre重组酶和增强绿色荧光蛋白（eGFP）的腺病毒载体消融未发酵的胚胎致死基因。然后详细阐述使用荧光激活细胞分选（FACS）纯化用腺病毒转导的细胞，并定量基因消融对细胞增殖，活力，转录组和原位同种异体移植物生长的影响。这些方法为 在体外 和体内鉴定和验证治疗靶点提供了一种有效且可推广的方法 。 这些方法还提供了低传代肿瘤衍生细胞的可再生来源，减少了 体外 生长伪影。这使得靶向基因的生物学作用可以在各种生物过程中进行研究，例如由分泌组介导的迁移，入侵，转移和细胞间通信。
Introduction
在过去二十年之前，人类癌症的治疗严重依赖放疗和化疗药物，这些药物通过破坏DNA或抑制DNA合成来广泛靶向快速增殖的细胞群。虽然这些方法确实抑制了癌细胞的生长，但它们对正常快速增殖的细胞类型（如肠上皮细胞和毛囊细胞）也有有害的副作用。最近，癌症治疗已经开始利用化疗药物，这些药物精确地靶向信号通路中的蛋白质，这对个体患者肿瘤的生长至关重要。这种方法通常被称为“精准医疗”，导致了不断扩大的单克隆抗体和小分子抑制剂库的发展。这些药物有效地抑制肿瘤细胞的增殖和存活，同时避免了常规化疗药物和放疗对正常细胞类型的有害副作用。用于治疗人类癌症的单克隆抗体最常靶向细胞表面分子，例如生长因子受体1 （例如，跨膜受体酪氨酸激酶的大家族）和免疫应答调节剂2 （例如，程序性细胞死亡蛋白1，程序性死亡配体1）。小分子抑制剂可以抑制细胞表面蛋白或位于细胞内的信号蛋白3。然而，为了有效地利用这些新的治疗剂，必须确定特定的癌症依赖于候选治疗剂所靶向的分子。
虽然这些新的治疗剂具有更集中的作用，但其中许多仍然抑制一种以上蛋白质的作用。此外，通常可以使用具有不同有效性和特异性的多种试剂来靶向特定蛋白质。因此，在临床前研究期间，明智的做法是使用其他方法（例如遗传消融）来验证候选蛋白质作为治疗靶标。验证蛋白质作为治疗靶点的一种特别有用的方法是在基因工程动物模型中消融编码候选蛋白质的基因，该模型开发特定的癌症类型。如果具有零突变（自然突变，基因工程零突变[“敲除”]或基因陷阱引入的零突变）的小鼠可用，并且小鼠存活到成年期，则这种方法可能相对简单。不幸的是，符合这些标准的具有零突变的小鼠通常不可用，通常是因为零突变导致胚胎死亡或在产后生命的最初几天死亡。在这种情况下，容易发生肿瘤型感兴趣的小鼠可以转而杂交到目的基因的关键片段被loxP位点（“floxed”）两侧的小鼠杂交，这允许通过将表达Cre重组酶的转基因引入肿瘤细胞（条件敲除）来消融该基因。此方法具有几个优点。首先，如果Cre驱动剂在肿瘤中表达，但不在导致常规敲除中死亡的细胞类型中表达，则这种方法可以潜在地验证候选治疗靶点。其次，在肿瘤细胞中烧蚀编码候选蛋白的基因，而不是在其他肿瘤内元素（如肿瘤相关成纤维细胞或免疫细胞）中，使研究者能够区分治疗靶点的细胞自主和非细胞自主效应。最后，他莫昔芬诱导的Cre驱动因子（CreERT2）允许研究者在肿瘤发展的不同阶段删除目的基因，并确定候选治疗剂最有可能有效的窗口。
不幸的是，还有一些技术问题可能会限制在GEM模型中出现的肿瘤中使用有条件敲除。例如，在肿瘤细胞中表达并避免生命所必需的正常细胞中基因缺失的Cre驱动器可能不可用。另一个可能被低估的问题是，Cre和CreERT2 驱动者经常可变地消融小鼠中絮状等位基因，导致GEM癌症中零突变的嵌合体。当这种情况发生时，靶向基因尚未消融的肿瘤细胞将继续快速增殖，用消融的等位基因过度生长肿瘤细胞。Cre驱动谱系中的马赛克化可能是由于目标谱系中非普遍的Cre表达以及独立于Cre表达4的单个细胞中的重组失败而发生的。这是Cre驱动因素的已知现象，与细胞类型有关，应在实验设计和数据解释期间考虑。Mosaicism可以掩盖敲除的影响，并导致研究人员错误地得出结论，即目的基因对肿瘤细胞增殖和/或存活不是必需的，因此不是有效的治疗靶点。
在之前的一项研究中遇到了其中一些问题，该研究试图确定受体酪氨酸激酶erbB4是否是MPNST细胞中的潜在治疗靶标5。在这些研究中，在施万细胞特异性髓鞘蛋白零启动子（P 0-GGFβ3小鼠）的控制下，使用表达编码神经肽-1（NRG1）同种型神经胶质生长因子-β3（GGFβ3）的转基因的小鼠。P 0-GGFβ3小鼠发展为多个丛状神经纤维瘤，通过概括常染色体显性肿瘤易感综合征1型（NF1）6型神经纤维瘤病的神经纤维瘤发病机制和丛状神经纤维瘤-MPNST进展的过程进展为MPNST。当与具有Trp53零突变的小鼠杂交时，所得P 0-GGFβ3;Trp53 +/-小鼠从头发展MPNSTs，如顺式Nf1 + / -;Trp53+/- 小鼠。
这些 MPNST 概括了在人类中从世界卫生组织 （WHO） II 级病变进展到 WHO IV 级病变7。在P 0-GGFβ3小鼠中，MPNSTs出现在三叉神经（58%）和脊髓背神经根（68%）7中预先存在的丛状神经纤维瘤内;在 P 0-GGFβ3 中产生的甲基物质免疫吸附剂;Trp53 +/-小鼠具有高度相似的分布。在人类中，MPNSTs最常出现在坐骨神经中，其次是臂丛神经，脊神经根，迷走神经，股骨，正中，骶丛，腘腘闭塞器以及胫骨后神经和尺神经8。这些GEM模型中的这种肿瘤分布与人类中的肿瘤分布有些不同。然而，在P 0-GGFβ3和P0-GGFβ3中出现的甲基卫星;Trp53 + / –小鼠在组织学上与人类MPNST相同，携带许多与人类MPNTS相同的突变，并概括了NF1患者中可见的神经纤维瘤 – MPNST进展过程。生成 P 0-GGFβ3 或 P0-GGFβ3;Erbb4–/-的Trp53+/-小鼠是不可行的，因为具有两个Erbb4空等位基因的小鼠在继发于心脏缺陷的胚胎第10.5天在子宫内死亡9。因为通过引入心脏特异性Erbb4转基因（α肌球蛋白重链（MHC）-Erbb4）来拯救心脏中的Erbb4表达导致活的Erbb4-/-小鼠10，产生具有复杂P 0-GGFβ3的小鼠;Trp53+/-α-麦格-埃尔布4;尝试了 Erbb4-/- 基因型。
然而，交配没有产生预期孟德尔比例的小鼠，表明所需的基因型是有害的。因此，生成P 0-GGFβ3;尝试使用具有絮状Erbb4等位基因11和CreERT2驱动程序的Trp53 + / –小鼠允许在这些小鼠中出现的MPNST中去除Erbb4。在这些动物中，许多具有完整Erbb4等位基因的肿瘤细胞仍然存在（嵌合体）。观察到的嵌合体可能是由于他莫昔芬递送效率低下造成的，这导致组织内重组效率的差异。自发代偿机制的可能性可以通过绕过Erbb4表达的要求，进一步促进他莫昔芬介导的重组中的嵌合体。Trp53的丢失使肿瘤细胞容易受到其他自发“允许”突变的影响，这可能会混淆对数据的解释。由于Erbb4完整的MPNST细胞似乎有可能掩盖在其他肿瘤细胞中烧蚀Erbb4的后果，因此这种方法被放弃了。
这些障碍导致了一种使用表达Cre重组酶和eGFP的腺病毒在非常早期的传代MPNST细胞中烧蚀Erbb4的方法。这些细胞可以使用FACS从未感染的细胞中分离出来，这显着减少了烧蚀的Erbb4基因的嵌合体。下面描述了用于实现这一目标的方法，以及用于评估基因消融在体外和体内效果的方法。以下方案是如何产生荷瘤小鼠的一个例子，这些小鼠在体内同种异体移植肿瘤生长评估之前产生携带目标胚胎致死基因的絮状等位基因的肿瘤。这包括描述用于分析Erbb4消融对体外肿瘤细胞增殖，存活和基因表达的影响以及原位同种异体移植物中的增殖，存活和血管生成的作用的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的详细方法是使用MPNST的GEM模型开发的。然而，如果感兴趣的肿瘤组织可以分散到单个细胞中，这些方法很容易适应GEM中出现的各种肿瘤类型。重要的是要确保絮状等位基因不会导致i）存活率下降，这可能使获得足够的小鼠难以筛查肿瘤，或ii）肿瘤潜伏期增加，可能使获得足够的荷瘤小鼠变得困难。如果絮状等位基因不影响存活，则两个队列的存活率将是相等的。如果它对肿瘤潜伏期?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（R01 NS048353，R01 NS109655），美国国家癌症研究所（R01 CA122804），国防部（X81XWH-09-1-0086，W81XWH-11-1-0498，W81XWH-12-1-0164，W81XWH-14-1-0073和W81XWH-15-1-0193）和儿童肿瘤基金会（2014-04-001和2015-05-007）的资助。
Materials
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
|
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347 (2019).
- Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
- Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218 (2012).
- Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74 (2019).
- Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
- Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
- Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
- Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
- Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
- Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
- Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
- Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
- Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
- Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
- Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
- Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577 (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28 (2016).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183 (2007).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984 (2010).
- Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919 (2016).
- Koch, C. M., et al. A beginner’s guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
- Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558 (2011).
- Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175 (2007).
- Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
- Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807 (2021).
- Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
- Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
- Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
