Definition von Genfunktionen in der Tumorgenese durch Ex-vivo-Ablation von Flox-Allelen in bösartigen peripheren Nervenscheidentumorzellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für die Durchführung von Gen-Knockouts vor, die in vivo in gentechnisch veränderten Mausmodell-abgeleiteten Tumoren embryonal tödlich sind, und bewerten dann die Wirkung, die der Knockout auf Tumorwachstum, Proliferation, Überleben, Migration, Invasion und das Transkriptom in vitro und in vivo hat.

Abstract

Die Entwicklung neuer Medikamente, die genau auf Schlüsselproteine bei menschlichen Krebserkrankungen abzielen, verändert die Krebstherapeutika grundlegend. Bevor diese Medikamente jedoch eingesetzt werden können, müssen ihre Zielproteine als therapeutische Ziele bei bestimmten Krebsarten validiert werden. Diese Validierung wird häufig durchgeführt, indem das Gen, das für das therapeutische Ziel in einem gentechnisch veränderten Mausmodell (GEM) von Krebs kodiert, ausgeschaltet und bestimmt wird, welche Auswirkungen dies auf das Tumorwachstum hat. Leider schränken technische Probleme wie die embryonale Letalität bei konventionellen Knockouts und der Mosaikismus bei bedingten Knockouts diesen Ansatz oft ein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein Ansatz zur Ablation eines abgeloxierten embryonalen tödlichen Gens entwickelt, das in Kurzzeitkulturen von bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs) von Interesse ist, die in einem GEM-Modell erzeugt wurden.

Dieses Papier beschreibt, wie man ein Mausmodell mit dem entsprechenden Genotyp etabliert, kurzfristige Tumorkulturen von diesen Tieren ableitet und dann das floxierte embryonale tödliche Gen mit einem adenoviralen Vektor abträgt, der Cre-Rekombinase und verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) exprimiert. Die Reinigung von Zellen, die mit Adenovirus transduziert wurden, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und die Quantifizierung der Auswirkungen, die die Genablation auf die Zellproliferation, Lebensfähigkeit, das Transkriptom und das orthotope Allotransplantatwachstum ausübt, wird dann detailliert beschrieben. Diese Methoden bieten einen effektiven und generalisierbaren Ansatz zur Identifizierung und Validierung therapeutischer Ziele in vitro und in vivo. Diese Ansätze bieten auch eine erneuerbare Quelle für von Tumoren abgeleitete Zellen mit niedriger Passage mit reduzierten In-vitro-Wachstumsartefakten. Auf diese Weise kann die biologische Rolle des Zielgens in verschiedenen biologischen Prozessen wie Migration, Invasion, Metastasierung und interzellulärer Kommunikation, die durch das Sekretom vermittelt werden, untersucht werden.

Introduction

Vor den letzten zwei Jahrzehnten stützte sich die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen stark auf Strahlentherapie und Chemotherapeutika, die im Großen und Ganzen auf sich schnell vermehrende Zellpopulationen abzielten, indem sie die DNA schädigten oder die DNA-Synthese hemmten. Obwohl diese Ansätze das Wachstum von Krebszellen hemmten, hatten sie auch schädliche Nebenwirkungen auf normale, sich schnell vermehrende Zelltypen wie Darmepithelzellen und Haarfollikelzellen. In jüngerer Zeit hat die Krebstherapie begonnen, Chemotherapeutika zu verwenden, die genau auf Proteine innerhalb von Signalwegen abzielen, die für das Wachstum des Neoplasmas eines einzelnen Patienten von entscheidender Bedeutung sind. Dieser Ansatz, der gemeinhin als “Precision Medicine” bezeichnet wird, hat zur Entwicklung eines ständig wachsenden Repertoires an monoklonalen Antikörpern und kleinen molekularen Inhibitoren geführt. Diese Wirkstoffe hemmen effektiv die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen und vermeiden gleichzeitig die schädlichen Nebenwirkungen auf normale Zelltypen, die bei herkömmlichen Chemotherapeutika und Strahlentherapie beobachtet werden. Monoklonale Antikörper, die zur Behandlung von Krebs beim Menschen eingesetzt werden, zielen am häufigsten auf Zelloberflächenmoleküle wie Wachstumsfaktorrezeptoren 1 (z. B. die große Familie membranübergreifender Rezeptor-Tyrosinkinasen) und Immunantwortmodulatoren 2 (z. B. programmiertes Zelltodprotein 1^, programmierter Todesligand¹⁾ ab. Kleine molekulare Inhibitoren können entweder Zelloberflächenproteine oder Signalproteine, die sich intrazellulär befinden, hemmen³. Um diese neuen therapeutischen Wirkstoffe effektiv einsetzen zu können, muss jedoch festgestellt werden, dass eine bestimmte Krebserkrankung von dem Molekül abhängt, auf das ein Therapiekandidat abzielt.

Obwohl diese neuen Therapeutika fokussiertere Wirkungen haben, hemmen viele von ihnen immer noch die Wirkung von mehr als einem Protein. Darüber hinaus sind oft mehrere Wirkstoffe mit unterschiedlicher Wirksamkeit und Spezifität verfügbar, um auf ein bestimmtes Protein abzuzielen. Daher ist es ratsam, bei präklinischen Studien zusätzliche Ansätze wie die genetische Ablation zu verwenden, um ein Kandidatenprotein als therapeutisches Ziel zu validieren. Ein besonders nützlicher Ansatz zur Validierung eines Proteins als therapeutisches Ziel besteht darin, das Gen, das für das Kandidatenprotein kodiert, in einem gentechnisch veränderten Tiermodell abzutragen, das die spezifische Krebsart von Interesse entwickelt. Dieser Ansatz kann relativ einfach sein, wenn Mäuse mit einer Nullmutation (entweder eine natürliche Mutation, eine gentechnisch veränderte Nullmutation [ein “Knockout”) oder eine Nullmutation, die durch eine Genfalle eingeführt wurde) verfügbar sind und die Mäuse bis ins Erwachsenenalter lebensfähig sind. Leider sind Mäuse mit einer Nullmutation, die diese Kriterien erfüllen, oft nicht verfügbar, typischerweise weil die Nullmutation zum embryonalen Tod oder in den ersten Tagen des postnatalen Lebens führt. Unter diesen Umständen können Mäuse, die dazu neigen, den interessierenden Tumortyp zu entwickeln, stattdessen zu Mäusen gekreuzt werden, bei denen Schlüsselsegmente des interessierenden Gens von loxP-Stellen flankiert werden (“floxed”), wodurch das Gen abgetragen werden kann, indem eine transgenexprimierende Cre-Rekombinase in die Tumorzellen eingeführt wird (ein bedingter Knockout). Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile. Erstens, wenn ein Cre-Treiber verfügbar ist, der im Tumor exprimiert wird, aber nicht in dem Zelltyp, der bei herkömmlichen Knockouts zum Tod führte, kann dieser Ansatz möglicherweise das therapeutische Ziel validieren. Zweitens ermöglicht die Ablation des Gens, das für das Kandidatenprotein kodiert, in Tumorzellen, aber nicht in anderen intratumoralen Elementen wie tumorassoziierten Fibroblasten oder Immunzellen, dem Prüfarzt, zwischen zellautonomen und nicht-zellautonomen Effekten des therapeutischen Ziels zu unterscheiden. Schließlich ermöglicht ein Tamoxifen-induzierbarer Cre-Treiber (CreER^T2) dem Prüfarzt, das Gen von Interesse in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung zu löschen und das Fenster zu definieren, in dem der therapeutische Wirkstoffkandidat am wahrscheinlichsten wirksam ist.

Leider gibt es auch technische Probleme, die die Verwendung von bedingten Knockouts bei Tumoren, die in GEM-Modellen auftreten, einschränken können. Zum Beispiel ist ein Cre-Treiber, der in Tumorzellen exprimiert wird und Gendeletion in normalen lebensnotwendigen Zellen vermeidet, möglicherweise nicht verfügbar. Ein weiteres Problem, das unterschätzt werden kann, ist, dass Cre- und CreER^T2-Treiber oft variabel floxierte Allele in Mäusen abtragen, was zu Mosaikismus für die Nullmutation in einem GEM-Krebs führt. Wenn dies geschieht, werden Tumorzellen, in denen das Zielgen nicht abgetragen wurde, weiterhin schnell vermehren und die Tumorzellen mit abgetragenen Allelen überwuchern. Mosaikismus in Cre-Treiberlinien kann aufgrund einer nicht allgegenwärtigen Cre-Expression in der Ziellinie und durch fehlgeschlagene Rekombination in einzelnen Zellen unabhängig von der Cre-Expression^{auftreten 4}. Dies ist ein bekanntes Phänomen von Cre-Treibern, das vom Zelltyp abhängig ist und bei der Versuchsplanung und Dateninterpretation berücksichtigt werden sollte. Mosaikismus kann die Wirkung des Knockouts maskieren und einen Forscher dazu bringen, fälschlicherweise zu dem Schluss zu kommen, dass das Gen von Interesse für die Proliferation und/oder das Überleben von Tumorzellen nicht essentiell ist und somit kein gültiges therapeutisches Ziel ist.

Mehrere dieser Probleme traten in einer früheren Studie auf, in der versucht wurde zu bestimmen, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase erbB4 ein potenzielles therapeutisches Ziel in MPNST-Zellen^{war 5}. In diesen Studien wurden Mäuse verwendet, die ein Transgen exprimieren, das für den_neuregulin-1 (NRG1) isoformen glialen Wachstumsfaktor-β3 (GGFβ3) kodiert, unter der Kontrolle des Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Nullpromotors (P 0-GGFβ3-Mäuse). P 0-GGFβ3-Mäuse entwickeln mehrere plexiforme Neurofibrome, die über einen Prozess, der die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression rekapituliert, die bei Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumorsuszeptibilitätssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1)⁶ beobachtet wurden, zu MPNSTs werden. Bei Kreuzung mit Mäusen mit einer Trp53-Nullmutation ergibt sich das resultierende P 0-GGFβ3; Trp53^+/– Mäuse entwickeln MPNSTs de novo, wie sie in cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- Mäuse.

Diese MPNSTs rekapitulieren die Entwicklung von Läsionen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) Grad II zu WHO-Grad IV, die beim Menschen beobachtet wurden⁷. Bei P 0-GGFβ3-Mäusen entstehen MPNSTs innerhalb bereits bestehender plexiformer Neurofibrome im Trigeminusnerv (58%) und spinalen dorsalen Nervenwurzeln (68%)⁷; die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 entstehen; Trp53^+/- Mäuse haben eine sehr ähnliche Verteilung. Beim Menschen entstehen MPNSTs am häufigsten im Ischiasnerv, gefolgt vom Plexus brachialis, den Spinalnervenwurzeln, dem Vagus, dem Femur, dem Median, dem Plexus sacralis, dem Obturator popliteus und den hinteren Tibia- und Ulnarnerven⁸. Diese Tumorverteilung in diesen GEM-Modellen unterscheidet sich etwas von dem, was beim Menschen beobachtet wird. Die MPNSTs, die in P 0-GGFβ3 und P_0-GGFβ3 auftreten; Trp53^+/– Mäuse sind histologisch identisch mit menschlichen MPNSTs, tragen viele der gleichen Mutationen, die bei menschlichen MPNSTs beobachtet wurden, und rekapitulieren den Prozess der Neurofibrom-MPNST-Progression, der bei NF1-Patienten beobachtet wurde. Die Erzeugung von P 0-GGFβ3 oder P_0-GGFβ3; Trp53^+/– Mäuse, die Erbb4-/- waren, waren nicht durchführbar, da Mäuse mit zwei Erbb4-Null-Allelen in utero am Embryonaltag 10,5 nach Herzfehlern^{starben 9}. Denn die Rettung der Erbb4-Expression im Herzen durch die Einführung eines herzspezifischen Erbb4-Transgens (α-Myosin-Schwerkette (MHC)-Erbb4) führt zu lebensfähigen Erbb4–/–^{Mäusen 10}, der Erzeugung von Mäusen mit einem komplizierten P ^0-GGFβ3; Trp53^+/-;α-MHC-Erbb4; Erbb4^-/- Genotyp wurde versucht.

Die Paarungen produzierten jedoch keine Mäuse in den erwarteten Mendelschen Verhältnissen, was darauf hindeutet, dass der gewünschte Genotyp schädlich war. Daher ist die Erzeugung von P 0-GGFβ3; Trp53^+/– Mäuse mit floxierten Erbb4-Allelen¹¹ und einem CreER^T2-Treiber wurde versucht, die Löschung von Erbb4 in den MPNSTs, die in diesen Mäusen entstehen, zu ermöglichen. Bei diesen Tieren waren noch zahlreiche Tumorzellen mit intakten Erbb4-Allelen vorhanden (Mosaikismus). Der beobachtete Mosaikismus könnte auf eine ineffiziente Tamoxifenabgabe zurückzuführen sein, die zu Unterschieden in der Rekombinationseffizienz innerhalb des Gewebes führte. Die Möglichkeit spontaner Kompensationsmechanismen könnte weiter zum Mosaikismus in der Tamoxifen-vermittelten Rekombination beitragen, indem die Anforderung an die Erbb4-Expression umgangen wird. Es ist möglich, dass der Verlust von Trp53 Tumorzellen anfällig für zusätzliche spontane “permissive” Mutationen macht, die die Interpretation der Daten verwirren könnten. Da es wahrscheinlich schien, dass die Erbb4-intakten MPNST-Zellen die Folgen der Ablagerung von Erbb4 in anderen Tumorzellen maskieren würden, wurde dieser Ansatz aufgegeben.

Diese Hindernisse führten zur Entwicklung einer Methodik zur Ablation von Erbb4 in sehr frühen Passage MPNST-Zellen unter Verwendung eines Adenovirus, das Cre-Rekombinase und eGFP exprimiert. Diese Zellen können mit FACS von nicht infizierten Zellen getrennt werden, was den Mosaikismus für das ablatierte Erbb4-Gen deutlich reduziert. Im Folgenden werden die Methoden beschrieben, die verwendet werden, um dies zu erreichen, zusammen mit den Methoden, die verwendet werden, um die Auswirkungen der Genablation in vitro und in vivo zu bewerten. Das folgende Protokoll ist ein Beispiel dafür, wie tumortragende Mäuse erzeugt werden können, die Tumore mit gefloxten Allelen embryonaler tödlicher Gene hervorbringen, die für die Ex-vivo-Exzision vor der Beurteilung des In-vivo-Allotransplantat-Tumorwachstums von Interesse sind. Dazu gehört eine Beschreibung der Ansätze, die verwendet werden, um die Wirkung zu analysieren, die die Erbb4-Ablation auf die Proliferation, das Überleben und die Genexpression von Tumorzellen in vitro sowie auf Proliferation, Überleben und Angiogenese in orthotopen Allotransplantaten ausübt.

Protocol

Vor der Durchführung von Verfahren mit Mäusen müssen alle Verfahren vom Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt werden. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt. Dieses Protokoll wurde von ordnungsgemäß geschultem Personal gemäß den institutionellen Tierpflegerichtlinien von MUSC durchgeführt. 1. Generierung von Mäusen, die MPNSTs homozygot für <…

Representative Results

Abbildung 4 zeigt ein typisches Ergebnis, das bei der Umleitung von P 0-GGFβ3 erzielt wird; Trp53-/+; Erbb4 fl/fl MPNST-Zellen entweder mit dem Ad5CMV-eGFP-Adenovirus oder Ad5CMV-Cre/eGFP-Adenovirus (Abbildung 4A). Kulturen werden mit Fluoreszenzmikroskopie betrachtet, um eGFP-exprimierende Zellen zu identifizieren, und mit Phasenkontrastmikroskopie, um die Gesamtzahl der im selben Feld vorhandenen Zellen bei 1…

Discussion

Die hier vorgestellten detaillierten Methoden wurden unter Verwendung eines GEM-Modells von MPNSTs entwickelt. Wenn das interessierende Tumorgewebe jedoch in einzelne Zellen zerstreut werden kann, sind diese Methoden leicht für verschiedene Tumorarten anpassbar, die in GEMs auftreten. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das floxierte Allel nicht zu i) vermindertem Überleben führt, das es schwierig machen kann, genügend Mäuse zu erhalten, um nach Tumoren zu suchen, oder ii) einer erhöhten Tumorlatenz, die es schwie…

Materials

Ad5CMV-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP	Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa	VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 secondary antibody	Thermo/Fisher	GaR A11036
Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics	Bioconductor	http://www.bioconductor.org	alternative statistical analysis tool used for step 4.4
CD31	Abcam	ab28364
Celigo Image Cytometer	Nexcelom Bioscience	N/A
Cell Stripper	Corning	25-056-Cl	mixture of chelators
DAB staining kit	Vector Labs	MP-7800
DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)	DAVID	https://david.ncifcrf.gov	functional enrichment analysis software used for step 4.5
DMEM	Corning	15-013-Cl
DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR)	Thermo/Fisher	EP0701 and K1072
erbB4 antibodies	Santa Cruz	sc-284
erbB4 antibodies	Abcam	ab35374
erbB4 antibodies	Millipore	HFR1: 05-1133
FACS Sorter	BD Biosciences	Aria II
Forskolin	Sigma	F6886
GenomeSpace Tools and Data Sources	GenomeSpace	https://genomespace.org/support/tools/	general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5
Glutamine	Corning	25-005-Cl
Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool	Gorilla	N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il	functional enrichment analysis software used for step 4.5
GSEA Gene Set Enrichment Analysis	Broad Institute	N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp	functional enrichment analysis software used for step 4.5
HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice	Envigo (Previously Harlan Labs)	69
Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer)	Illumina	Hi Seq 2500	DNA sequencer used for step 4.2
Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis	DNAStar LaserGene software	N/A	software statistical and normalization analysis used for step 4.4
Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly	software alignment used for step 4.3	N/A	software alignment used for step 4.3
Matrigel, low growth factor basement membrane matrix	Corning	354230
NRG1-beta	In house	Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF).
Nuclear Stain Hoeschst 33342	Thermo	62249
Panther Gene Ontology Classification System	Panther	http://pantherdb.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Partek (BWA aligner and analyzer)	Partek, Ver 7	N/A	software alignment and statistical/normalization used for step 4.3
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product;
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′	Eurofins Genomics	Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product.
Propidium Iodine	Fisher	51-351-0
Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays	R&D Systems	ARY003B
Real time glo	Promega	G9712	bioluminescent cell viability assay
ToppGene Suite	ToppGene	https://toppgene.cchmc.org	functional enrichment analysis software used for step 4.5
Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent)	Invitrogen	15596026
Tyramide Signal Amplification Kit	Perkin Elmer	NEL721001EA