Summary
마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila에서액체 음식 소비를 정량화하기 위한 경제적이고 높은 처리량 방법을 제공합니다. 3D 프린팅 장치는 파리가 트레이서 염료로 공급 용액을 소비하는 1536웰 마이크로 플레이트에 파리가 보관되는 96웰 마이크로 플레이트를 연결합니다. 용액 량 감소는 분광계로 측정됩니다.
Abstract
Drosophila에서 음식 섭취를 정량화하는 것은 소비 관련 특성의 유전적 및 생리적 기초를 연구하는 데 사용됩니다, 그들의 환경 요인, 수많은 물질의 독성 및 약리학적 효과. 현재 구현된 몇 가지 방법은 높은 처리량 측정에 사용 가능합니다. 마이크로 플레이트 피더 분석(MFA)은 흡수도를 사용하여 개별 파리에 대한 액체 식품의 소비를 정량화하기 위해 개발되었습니다. 이 분석에서 파리는 1536 웰 마이크로 플레이트의 일부 우물에서 액체 식품 매체를 소비합니다. 희석 트레이서 염료를 액체 식품 배지에 통합하고 각 우물에 알려진 부피를 적재함으로써, 소비 전후에 잘 획득한 음량의 흡광도 측정은 부피의 결과적 변화를 반영한다(즉, 소비된 부피). 이 방법을 사용하여 높은 처리량 분석을 가능하게 하기 위해 3D 프린팅 커플러는 파리를 96웰 마이크로플레이트로 개별적으로 정렬할 수 있도록 설계되었습니다. 이 장치는 정확하게 96- 및 1536-웰 마이크로 플레이트를 지향하여 각 비행에 최대 4 개의 우물까지 사용할 수 있으므로 일반 소비 외에도 식품 선호도 정량화를 가능하게합니다. 또한 이 장치에는 개방된 위치와 닫힌 위치 사이를 전환하여 한 번에 샘플 열의 제어 및 방출을 허용하는 배리어 스트립이 있습니다. 이 방법을 사용하면 많은 플라이가 동시에 수성 솔루션의 소비를 높은 처리량 측정할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 곤충에 적응 하 고 영양소의 소비를 검사 하는 잠재력을 가지고, 독 소, 또는 제약.
Introduction
Drosophila 멜라노가스터는 음식 섭취의 생물학적 기초와 소비와 관련된특성1을연구하기 위해 유전 적 모델 유기체로서 폭넓은 사용을 보았습니다. 인간 질환을 유발하는 유전자의 65%가 파리에 기능적인 동종학을 가지고 있으며, 그 중 상당수는 파리와 인간 사이의 기능적으로 동등한 조직에서 발현되는것으로 추정된다 2. 또한, D. 멜라노가스터의 크기, 짧은 세대 간 시간, 간단한 유지 보수 및 유전 적 학력은 살충제5,오염 물질6,제약7,및 남용8,9,10의약물을 포함한 다양한 물질의 영양소3,4 및 독성 및 약리학적 효과의 소비에 대한 연구를위한 매력적인 모델입니다.
많은 경우에, 이러한 특성의 연구는 소비의 정확한 정량화가 필요합니다. 정량화 소비방법은 다양하며, CApillary FEeder (CAFE) 분석11,MAnual FEeding (MAFE) 분석12,프로보시스 확장 응답 (PER) 분석13,추적자 염료 추출14,15,올리고뉴클레오티드 추적기 추출16,및 라디오 isotop추출17을포함한다. 최근 의노력은 Expresso 분석18 또는 플레이트 기반의 전체 동물 먹이 FLat (WAFFL) 시스템 (WAFFL) 시스템에서와 같이 이러한 분석의 처리량을 향상시키는 데 초점을맞추고있다. 그들의 유용성에도 불구하고, 이 연구는 높은 처리량 연구 결과에서 그들의 사용을 방해하는 복잡하거나, 비용이 많이 드는, 또는 노동 집약적일 수 있습니다.
도 1: 마이크로 플레이트 피더 분석의 구성 요소. (A)조립 된 마이크로 플레이트 피더 분석기의 3D 렌더링. 1536-웰 마이크로 플레이트는 3D 프린팅 커플러에 의해 지향되어 낮은 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰이 상위 1536웰 마이크로 플레이트의 4개의 우물에 접근할 수 있도록 합니다. 웰에 대한 액세스는 커플러를 통해 슬롯 배리어 스트립의 위치를 조정하여 제어 할 수 있습니다. (B)마이크로 플레이트 피더 분석기의 각 웰의 그래픽 표현. 소비 솔루션은 플라이에 의한 액세스를 허용하기 위해 천포된 밀봉 필름을 사용하여 각 우물에 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마이크로 플레이트 피더 분석기의 절차 개요. 그림은 프로토콜의 4.1-5.8 단계에 해당하는 흐름 다이어그램을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 장애물을 극복하기 위해 마이크로 플레이트 피더 분석기 (MFA; 그림 1) 개발되었습니다. 이 분석에서 파리는 96웰 마이크로 플레이트에 개별적으로 보관됩니다. 각 마이크로 플레이트는 사용자 정의 3D 인쇄 장치를 사용하여 1536 웰 마이크로 플레이트에 결합됩니다. 이 장치는 각각 96웰 플레이트의 각각 우물에서 비행할 수 있도록 두 플레이트를 정확하게 방향을 지정하여 1536웰 마이크로플레이트의 4개의 웰에 접근할 수 있습니다. 바닥이 없는 1536웰 플레이트와 밀봉 필름을 사용하여 용액을 일부 우물에 분배하고 정확한 직경 0.25mm 바늘로 천포처리되어 파리에 접근할 수 있습니다. 비판적으로, 마이크로 플레이트에서 직접 소비를 허용하면 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 즉각적인 흡광도 기반 측정이 가능합니다. 희석 트레이서 염료는 소비 배지에 통합되고, 노출 후 흡광도의 변화가사용된부(도 2 및 도 3)를결정한다. 각 우물의 액체는 유체 의 기둥에 근사하기 때문에 볼륨 차이는 컬럼의 높이에 차이가 나타납니다. (그림3A) 맥주 램버트 법에 따르면20:
여기서 A는 흡수성, ε 감쇠 된 질립을 위한 어금다 흡수 계수이며, l은 광학 경로 길이이며, c는 감쇠 된 질립물의 농도이다. 따라서, 일정한 어음 흡수 계수 및 농도를 통해, 흡광도의 변화는 전적으로 광학광 경로, 즉 주어진 우물 내의 유체 수준 내의 변화에 기인한다. 노출 전후의 흡광도를 측정함으로써 흡광도의 비례 변화는 부피의 비례 변화를 반영한다(도3B).
도 3: 잘 볼륨의 흡광도 기반 정량화. (A)알려진 입력 강도(I0)의인시던트 라이트는 각각 잘 통과한다. 다른 채우기 볼륨에서 빛의 감쇠는 볼륨과 흡광도 사이의 선형 관계를 나타내는 다른 출력 강도(I)를산출한다. (B)흡광도 의 경험적 측정 대 부피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
부피의 변화에 기초하여, 임의의 섭취 화합물의 양은 공급 용액에서 알려진 농도로부터 계산될 수 있다. 분석에 필요한 부품은 비용이 낮고 재사용성이 높으며 분석의 반복 비용을 크게 줄입니다. 따라서,이 절차는 정확하게 소비를 정량화하는 저렴하고 높은 처리량 방법을 제공합니다.
Protocol
1. 기아 플레이트 준비
- 250mL 유리 비커에 아가로즈 1.5 g의 무게를 내다.
- 증류된 H2O 100mL을 비커에 추가합니다.
- 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 간헐적으로 전자 레인지.
참고 : 아가로즈가 끓는 경향이 있기 때문에 비커를 관찰하십시오. - 용융 아가로즈를 시약 트로프에 붓고 다중 채널 파이펫을 사용하여 96웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 용융 아가로즈 80 μL을 분배합니다. 실온에서 덮는 동안 플레이트가 치료되도록 허용하십시오. 남은 아가로즈를 밀봉된 가방에 최대 1주일 간 냉장 보관하고 다시 녹여 접시를 만듭니다.
2. 플라이 정렬 및 기아
- 배리어 스트립을 장벽 스트립 채널에 삽입하여 커플러를 준비합니다. 배리어 스트립이 너무 느슨하면 손가락 주위에 코일하여 곡률을 채널에 고정시하십시오.
- 커플러를 기아 접시에 부착합니다. 커플러가 미끄러질 수 있기 때문에 커플러를 사용하여 접시를 조작하지 마십시오. 커플러가 올바르게 방향을 조정되었는지 확인합니다(예: 커플러의 각진 모서리가 마이크로 플레이트의 각진 모서리와 일치하는지 확인합니다).
- CO2 마취(재료의 표)에서정렬 3-5 일 된 파리. 개별 파리를 기둥으로 감전 플레이트에 넣습니다.
참고: 파리는 열별로 로드되지만 아래열이 아닌 플레이트행 아래로 샘플 그룹을 배포하는 것이 좋습니다(플레이트 레이아웃 예제의 그림 4 참조). - 배리어 스트립을 닫힌 위치로 조정하여 채우면 각 열을 닫습니다.
그림 4: 대표 기아 플레이트 레이아웃. 다이어그램은 이 연구에서 사용되는 96웰 플레이트에서 증발 제어 및 남성과 여성 파리의 조직을 보여줍니다. A행과 H행의 증발 제어가 있는 수컷및 암컷의 교대열을 포함한 대체 구성도 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 마이크로 플레이트 내에서 샘플 레이아웃을 신중하게 기록합니다. 기아 판이 채워지면 CO2를 제거한 후 파리가 자발적으로 회복되고 초기 마취 시간부터 6시간 동안 굶어 지을 수 있습니다.
3. 액체 식품 준비
참고: 매일 액체 식품을 신선하게 만듭니다.
- 증류H2O에서FD&C 블루 #1의 10 mg/mL의 염료 스톡 솔루션을 준비하십시오.
참고: 최대 6개월 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. - 10mL의 액체 식품(4% 자당, 효모 추출물 1%, FD&C 블루#1의 40 μg/mL)을 15mL 원추형 튜브에 10mL의 자당0.4g, 효모 추출물 0.1g을 10mL의 증류H2O. 소용돌이까지 10mL로 준비한다. 40 μL의 염료 스톡 용액을 추가하고 튜브를 반복적으로 반전하여 용액을 균질화합니다.
- 액체 식품을 0.45 μm 필터로 기울어진 10mL 주사기로 옮습니다. 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브로 한 번에 용액의 ~1.5mL를 필터. 용액을 포함하는 주사기를 제쳐두고 피더 플레이트 준비 중에 필요에 따라 추가 용액을 필터링합니다.
4. 피더 플레이트 준비
참고: 흡수도 판독값에 영향을 줄 수 있는 우물의 거품이나 물방울의 형성을 방지하기 위해 충전 후 피더 플레이트를 부드럽게 처리합니다.
- 밀봉 필름으로 1536웰 마이크로 플레이트의 바닥을 밀봉하여 피더 플레이트를 준비합니다. 밀봉 패들을 사용하여 필름을 철저히 고수하십시오. 면도날로 왼쪽과 오른쪽 가장자리에서 초과 필름을 다듬습니다.
- 여과된 액체 식품 컬럼의 10 μL을 1536웰 마이크로플레이트의 적절한 우물에 분배합니다(그림 5 참조). 4개의 우물의 각 클러스터에 대해 왼쪽 위쪽에 분배합니다(그림 5 참조).
그림 5: 1536 웰 피더 플레이트의 수와 위치가 잘 채워지세요. 다이어그램은 프로토콜의 4.2 단계를 보여 줍니다. 화살표는 공급 용액이 열 1에서 12까지 한 번에 하나의 컬럼을 피더 플레이트에 도입하는 순서를 보여 준다. 샘플 B1은 1선택 및 2선택 에세이에 대한 공급 솔루션의 위치의 예를 보여주기 위해 확대된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 모든 우물이 채워지면 접시 상단에 밀봉 필름을 적용하십시오. 밀봉 패들을 사용하여 필름을 철저히 고수하십시오. 면도날로 왼쪽과 오른쪽 가장자리에서 초과 필름을 다듬습니다. 원하는 플레이트 수를 반복합니다.
- 10s용 200 x g의 플레이트를 원심분리하여 유체를 정착시합니다. 이 우물에서 축적 응축을 일으킬 수 있기 때문에 접시가 냉각 되지 않도록, 감격 측정을 가리는.
5. 노출
- 파리가 소비 분석에 대한 준비가되면, 0.25mm 직경 바늘이 장착 된 바늘 프로브 도구를 장착 한 플레이트의 상단 표면에 우물을 천공. 동일한 순서를 사용하여 솔루션을 분배할 때 사용했던 대로 천포화하십시오. 접시를 뒤집고 바닥에 있는 우물을 천명합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 용액 사이에 바늘을 닦아냅니다. 이 우물에서 용액을 심지로 천포를 만지지 않도록주의하십시오.
- 뚜껑없이 630 nm에서 플레이트의 흡광도를 읽습니다.
- 응축 링이 천공 된 우물을 둘러싸고 있는지 확인하기 위해 상단 밀봉 필름에 내부 뚜껑을 놓습니다. 외부 뚜껑을 접시에 놓습니다.
- 피더 플레이트를 커플러에 올려 놓아 가이드가 피더 플레이트와 기아 플레이트의 적절한 구멍을 정렬합니다. 커플러와 플레이트가 올바르게 지향되는지 확인합니다(예: 커플러의 각진 모서리와 플레이트가 일치하는지 확인). 상단 및 하단 플레이트 주위에 탄성 밴드를 감싸서 커플러를 함께 고정합니다. 피더 플레이트와 커플러 사이의 정렬 및 간격을 확인합니다.
- 모든 피더 플레이트가 커플러에 로드되면 커플러의 배리어 스트립을 조정하여 플레이트의 우물을 엽니다. 커플러/플레이트 어셈블리를 보조 컨테이너에 배치합니다. 각 보조 컨테이너는 최대 6개의 어셈블리를 수용할 수 있습니다.
- 각 보조 용기에 담근 종이 타월이 들어 있는 파이펫 박스의 하반부에 놓아 습도를 제공합니다. 보조 용기의 뚜껑을 닫고 제어 된 환경 (25 ° C, 습도 제어, 12 h 빛 : 어두운 주기)로 전송합니다. 파리를 22시간 동안 소비하도록 허용합니다.
- 22h 노출 후, 죽은 파리에 대한 각 플레이트를 확인하고 그에 따라 플레이트 레이아웃을 업데이트합니다. 모든 플레이트를 검사한 후 보조 용기 내부에 CO2를 펌핑하여 파리를 대량으로 마취합니다. ~60년대 후에는 모든 파리가 고정되어 있는지 확인합니다. 파리를 부드럽게 굶주림 판에 넣고 플라스틱 배리어 스트립을 교체합니다. 판독을 위해 피더 플레이트를 제거합니다.
- 630 nm에서 플레이트의 흡광도를 다시 읽으십시오. 모든 플레이트가 판독될 때까지 반복합니다.
6. 데이터 분석
참고: 조사관이 선호하는 소프트웨어 패키지로 분석을 수행할 수 있습니다.
- 22시간 노출 중에 죽은 파리를 생략하십시오.
- 각 음에 대해 다음과 같이 소비된 볼륨을 계산합니다.
C - 소비된 부피(μL)
V - 초기 우물 부피 (즉, 10 μL)
ABS0 - 노출 전 흡수도
ABS1 - 노출 후 흡수성
참고: 소비는 계산에서 양수 볼륨으로 표시됩니다. - 증발을 고려하려면 각 플레이트 내의 플라이 소비 값에서 평균 증발 량을 뺍니다. 2선택/기본 설정 테스트의 경우, 증발 컨트롤에서 "선택 1" 우물을 "선택 1" 우물을 조정하는 것과같은각 솔루션에 따라 모든 우물을 조정합니다.
- 증발을 조정한 후 소비 값이 0미만인 샘플을 놓습니다.
- 2선택 테스트의 경우 각 테스트와 각각의 기본 설정을 계산합니다.
P - 기본 설정 지수(양수 방향은 선호도를 나타냅니다)
FA - 첨가제를 함유한 액체 식품의 부피 (선택 2)
FN - 소비된 일반 액체 식품의 부피 (선택 1)
7. 마이크로 플레이트 및 커플러 세척 프로토콜.
참고: 손상이 밀봉에 영향을 줄 수 있기 때문에 마이크로 플레이트 의 바닥이 손상되는 것을 방지하기 위해 주의하십시오.
- 1536웰 마이크로플레이트에서 필름과 라벨을 제거합니다. 커플러와 배리어 스트립을 분리합니다. 병과 같은 밀봉 가능한 용기에 장벽 스트립을 놓습니다. 따뜻한 수돗물, 순한 세제 용액, 따뜻한 수돗물, 그리고 H2O 증류로 장벽 스트립을 씻으릅니다.
- 따뜻한 수돗물 아래에서 1536웰의 마이크로 플레이트와 커플러를 헹구습니다. 마이크로 플레이트의 경우 각 마이크로 플레이트의 우물을 통해 수돗물을 실행하여 가능한 한 많은 용액과 이물질을 제거하십시오. 필요한 경우 파이펫 팁을 사용하여 이물질을 제거합니다. 접시에 금속 이나 유리 기구를 사용 하지 마십시오.
- 가벼운 세제 용액 (예 : 1 % v / v Aquet)으로 각 플레이트와 커플러를 덮습니다. 플레이트의 경우 장갑을 낀 손으로 표면을 문질러 보냅니다. 커플러의 경우 브러시를 사용합니다.
- 각 접시를 수돗물로 철저히 헹구고 증류된 H2O. 우물이 물 흐름 아래에서 특별히 헹구도록 하십시오.
- 접시와 커플러가 실온에서 덮은 공기를 건조하게 합니다. 사용할 때까지 깨끗한 보관 함서에 보관하십시오.
참고: 장갑없이 1536 잘 마이크로 플레이트를 처리하지 마십시오. 피부의 잔류 오일은 밀봉을 방해하여 누출과 증발을 잘 이끌어 냅니다.
Representative Results
개별 플레이트의 우물 사이에 상관 관계가 있는지 여부를 결정하기 위해 증발은 모든 우물(3플레이트에 대한 96개의 우물/플레이트)에 대해 정량화되었다. 증발은 -0.036 μL ± 0.003 μL(전체 의 평균 ± SEM)으로 나타났다. (그림6A) Pearson 상관 관계는 증발과 잘 위치 사이의 추세를 평가하기 위해 계산되었습니다. 증발 대 행에 대한 상관 계수(도6B,C)는-0.04(p = 0.4949)이고 열 대 증발의 경우 -0.23(p = 0.0001)이었다. 그룹은 이후 열 간에 온화하지만 통계적으로 유의한 상관 관계를 완화하기 위해 열 간에 배포되었습니다.
그림 6: MFA에서 증발. (A)대시 라인에 의해 표시된 평균 ± SD와 함께 증발 변화의 밀도 분포. 표시된 바와 같이 Pearson 상관 계수 및 p-값과 증발 및행(B)또는열(C)간의 상관관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
프로토콜의 유효성을 확립하기 위해 3-5일 된 캔톤-S B 플라이(n= 36/sex/plate 및 n=24 증발 컨트롤/플레이트 3플레이트용)에 대한 소비를 정량화하였다(그림7). 대조군 우물 간의 증발은 0(-0.030 μL ± 0.006 μL, p = 4.81 x 10-6;1개의 샘플 t-test대 0)과 크게 달랐다. 2개의 견본은 데이터 집합에서 생략되었습니다 (둘 다 남성), 하룻밤 노출 도중 죽음 때문에 이고 다른 하나는 증발을 위한 조정 다음 부정적인 소비 값 때문에 기인했습니다. 이것은 > 99%의 샘플 보존율을 산출했습니다.
그림 7: MFA를 이용한 소비 정량화. (A)소비는 맞춤형 제조 유리 챔버를 사용하여 시각화하였다. 파리는 천포된 우물에서 마시는 것을 관찰하고 염색 된 용액의 섭취 후 파란색 복부 염색을 나타냈다. 또한 증발 제어, 수컷 파리 및 암컷 파리 중 추가 비디오 S.1. (b)소비 값(평균 ± SEM)을 참조하십시오. 통계 비교를 위해 비등한 차이를 갖는 쌍방향 포스트 hoct-test가 수행되었으며, 바에 의해 표시된 유의성을 갖는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이어서, 분산(ANOVA) 모델은 Y=μ + S + P + SxP + e에 의해 설명된 바와 같이, Y와 함께 전체평균으로, μ S는 성별의 고정효과로서, P는 판의 고정효과로서, SxP는 성별과 플레이트 간의 상호작용으로서, 및 e를 잔류가 변이성으로 구성하였다. ANOVA는 소비를 위한 플레이트-플레이트 가변성(p = 0.671) 또는 성별 상호작용(p = 0.104)을 나타내지 않았으며, 섹스만으로도 소비의 관찰된 변동(p = 4.17 x10-18)에크게 기여했다. 포스트 hoct-test는 남성이 여성 (0.500 μL ± 0.017 μL vs 0.811 μL ± 0.028 μL, p = 1.13 x 10-17,2 개의 샘플 t-test-불합리한 분산을 가진 것으로 나타났습니다)
분석법이 2선택 선호도 정량화에 사용될 수 있음을 입증하기 위해, 파리는 1% 효모 추출물과 15% 에탄올과 1% 효모 추출물로 보충된 4% 자당 용액의 4% 자당 용액 사이에서 선택할 수 있었다. 남성과 여성 모두 남성용 0.974 ± 0.026, 여성용 0.876 ± 0.06(평균 ± SEM)(그림8)을선호하는 에탄올 및 효모 추출물을 함유한 용액에 대한 선호도가 압도적인 것으로 나타났다.
그림 8: MFA를 사용하여 기본 설정 정량화. 4% 자당 대 4% 자당의 소비는 남성과 여성 파리에 대한 15 %의 에탄올과 효모 추출물로 보충 (각 섹스에 대한 n = 33). 수컷 파리는 제어 자당 용액(0.511 μL ± 0.029 μL 대 0.017 μ ±L, p = 4.06e-10; 2-샘플 t-test)보다더 많은 에탄올 용액을 소비하였다. 암컷 파리는 또한 제어 자당 용액(0.939 μL ± 0.044 μL 대 0.132 μL ± 0.044 μL, p = 7.38e-17;2-샘플 t-test)보다 더 많은 에탄올 용액을 소비했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S.1: 비디오는 천공 우물에서 플라이 공급과 염색 된 용액을 섭취하는 동안 파란색 복부 염색을 축적보여줍니다. 스틸 이미지는 그림 7A에표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S.2 : 마이크로 플레이트 피더 분석 커플러. 이것은 MFA에 사용되는 커플러의 3D 인쇄 가능한 구조입니다. 인쇄 재료 나일론 PA12는 MFA에 사용되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S.3: 마이크로 플레이트 피더 분석 장벽 스트립. 여기에는 피더 플레이트에 파리노출을 전환하는 데 사용되는 플라스틱 배리어 스트립의 설계가 포함되어 있습니다. 단일 커플러는 최대 12개의 배리어 스트립을 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S.4: 마이크로 플레이트 피더 분석에 대한 포장 풀기 및 제작 지침. 커플러와 배리어 스트립의 포장을 풀기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 노출 시 증발을 제한하는 데 사용되는 내부 뚜껑, 외부 뚜껑 및 보조 용기에 대한 제조 지침이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 S.5:마이크로 플레이트 피더 분석기 (MFA)와 1 선택 단일 플라이 CApillary FEeder (CAFE) 분석의 비용 비교. 한 줄에 대해 72파리/성별을 테스트하려면 두 세트의 MFA 장비(커플러 + 플레이트 + 배리어 스트립)가 필요하며 CAFE는 각 문화 유리병에 대해 1개의 모세혈관만 필요합니다. MFA에 대한 초기 투자의 큰 차이에도 불구하고, 반복 비용의 큰 차이 ($ 14.80 대 $46.08, 각각) 4 라인 (손익분기 점)을 테스트 한 후 선행 비용을 복구 할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
연구 결과는 Drosophila에있는 소비를 정량화하기 위한 새로운 프로토콜을 기술합니다 : 마이크로 플레이트 피더 분석기 (MFA). 이 분석에서, 파리는 제어 된 크기 천공을 통해 1536 잘 마이크로 플레이트의 밀봉 된 우물에서 소비(그림 1, 도 2; 보충 비디오 S.1). 액체 식품은 마이크로 플레이트를 통해 염색되고 제공되기 때문에, 식품의 광학 흡광도의 측정은 마이크로 플레이트 분광계(도 3)를사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로, 소비는 소비 전후의 흡광도를 비교한 다음, 소비 전에 분배된 공지된 부피에 이 비율을 적용함으로써 결정된다. 이는 염색된 배지의 상이한 부피의 흡광도를 측정하여 경험적으로 검증되었다(도3B).
이 분석기를 개발하기 위해 흡수성 기반 소비 정량화를 활용할 수 있는 장치가 필요했습니다. 마이크로 플레이트 형식으로 파리를 테스트하는 것은 음식을 분배하는 데 사용되는 마이크로 플레이트를 보완하고 커플러 형상을 조정하여 여러 플레이트 형식(예: 6-, 12-48, 또는 96웰 형식)에서 선택할 수 있는 유연성을 허용하기 때문에 매력적입니다. 96웰 마이크로플레이트 형식은 개별 비행 문화를 허용하도록 선택되었습니다.
3D 프팅장치(도 1)는96웰 배양 플레이트를 사용하여 1536웰 피더 플레이트를 정확하게 방향을 지정하여 각 플라이에 피더 플레이트의 최대 4웰까지 공급할 수 있습니다. 또한, 하우징 플레이트에 파리를 분배하고 분석 개시를 제어하기 위한 적절한 시간을 제공하기 위해, 이 장치는 각각의 우물에 파리를 포함하는 장벽 스트립을 토깅하고 위반을 방지하는 것을 포함한다. 이러한 부품을 조달하거나 수정하는 데 필요한파일(보충 파일 S.2-S.3)과관련 부품에 필요한 제작 지침(보충 파일S.4)이제공됩니다.
MFA는 Drosophila 먹이동작(18,21,22)을모니터링하는 보다 정교한 방법을 보완하는 간단한 높은 처리량 방법을 제공한다. MFA는 음식 섭취량을 정량화하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다. 처리량은 플레이트 판독기를 사용하여 소비를 정량화하여 증가합니다. 이렇게 하면 수동 측정이 제거되고 수동 데이터 입력이 제거됩니다. 데이터는 프로그래밍 방식으로 추출 및 처리에 만 전할 수 있습니다. 또한, 처리량이 높을수록 생물학적 복제물의 실현 가능한 수가 증가하고, 특히 소비의 작은 차이를 감지하는 힘을 실질적으로 증가시키는 공동 피더 설계에 비해. MFA를 사용하여 단일 실험자는 분석의 하룻밤 실행당 500 개 이상의 파리의 소비 또는 선호도를 정량화 할 수 있습니다. 분석의 중복 실행을 통해, 이상 2,000 파리는 5 일 기간에 테스트 할 수 있습니다. 마지막으로, 마이크로 플레이트및 커플러(보충파일 S.5)의재사용성으로 인해 장기 비용 절감이 가능합니다. MFA를 사용하면 분석당 예상 비용은 $14.80까지 낮을 수 있으며 장비의 선불 비용은 $127.60입니다. 고전적인 CApillary FEeder (CAFE) 분석, 비용이 많이 드는 정밀 미세 한 증세 혈관을 필요로 하는, 복제의 비교 수에 대 한 분석 당 예상 비용은 $46.08. 따라서 필요한 장비 획득에 대한 선행 투자가 있지만 반복 비용의 감소는 특히 반복 테스트가 수행되는 경우에 상당한 절감으로 이어질 수 있습니다.
모든 분석과 마찬가지로 MFA에는 특정 제한 사항이 있습니다. 주로 1536개의 마이크로플레이트를 판독할 수 있는 마이크로플레이트 분광광계에 접근해야 합니다. 또한 정량화용 흡광도 측정에 의존하면 이 방법이 광학 간섭에 취약해집니다. 이는 테스트된 샘플의 작은 하위 집합에 대한 음수 소비 값으로 나타납니다. 영양소, 약물, 제약 또는 관심의 독소도 분석과 호환되도록 수용성이어야 합니다.
그 한계에도 불구하고,이 방법은 Drosophila에서소비 행동을 정량화하는 높은 처리량 방법을 제공합니다. 더욱이, 커플링 장치는 다양한 곤충 종을 수용할 수 있도록 많은 판 형식을 수용하기 위해 쉽게 변형될 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 TFCM과 RRHA에 국립 약물 남용 연구소 (U01 DA041613)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
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