क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी
Summary
यह पेपर क्रायो-ईएम प्रयोगों के लिए ठंड से पहले, 70 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) प्रयोगों के लिए नमूना ग्रिड आमतौर पर जैविक नमूनों के भंडारण के लिए इष्टतम तापमान पर तैयार किए जाते हैं, ज्यादातर 4 डिग्री सेल्सियस पर और कभी-कभी कमरे के तापमान पर। हाल ही में, हमने पाया कि कम तापमान पर हल की गई प्रोटीन संरचना कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक नहीं हो सकती है, खासकर थर्मोफिलिक आर्किया से प्रोटीन के लिए। क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए उच्च तापमान (70 डिग्री सेल्सियस तक) पर प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई थी। हमने दिखाया कि उच्च तापमान पर तैयार किए गए नमूनों से संरचनाएं कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक और तापमान पर निर्भर हैं। यहां हम एक उदाहरण के रूप में 55 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके उच्च तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रयोग ने एक अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके संशोधित एक विट्रीफिकेशन उपकरण का उपयोग किया, और नमूने 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए गए। वाष्प संघनन को कम करने और ग्रिड पर बर्फ की एक पतली परत प्राप्त करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को ठीक किया गया था। सफल और असफल प्रयोगों के उदाहरण प्रदान किए गए हैं।
Introduction
प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को हल करने के लिए क्रायो-ईएम तकनीक में सुधार जारी है, विशेष रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को प्राप्त करने की दिशा में 1,2। इस बीच, इसके आवेदन के परिदृश्य को विटिफिकेशन प्रक्रिया3 से पहले पीएच या लिगेंड जैसी नमूना स्थितियों को बदलकर विस्तारित किया गया है, जिसमें नमूना ग्रिड की तैयारी शामिल है, जिसके बाद फ्रीजिंग 4,5 है। एक और महत्वपूर्ण स्थिति तापमान है। यद्यपि क्रायो-ईएम प्रयोग, जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, कम तापमान पर किए जाते हैं, क्रायो-ईएम द्वारा हल की गई संरचना विट्रीफिकेशन से पहले समाधान अवस्था में संरचना को दर्शाती है। हाल ही में, अधिकांश एकल कण विश्लेषण (एसपीए) क्रायो-ईएम अध्ययन उन नमूनों का उपयोग करते हैं जो विट्रीफिकेशन6 से पहले बर्फ (यानी, 4 डिग्री सेल्सियस पर) पर रखे जाते हैं, हालांकि कई अध्ययन कमरे के तापमान 7,8,9,10 या 42 डिग्री सेल्सियस 11 के आसपास नमूनों का उपयोग करते हैं। हाल की एक रिपोर्ट में, हमने थर्मोफिलिक आर्कियन सल्फोलोबस सोलफैटारिकस (एसएसओ) से एंजाइम केटोल-एसिड रिडक्टोइसोमेरेज़ (केआरआई) के तापमान-निर्भर अध्ययन 4 डिग्री सेल्सियस से 70 डिग्री सेल्सियस12 तक छह अलग-अलग तापमानों पर किए। हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करना महत्वपूर्ण है और क्रायो-ईएम एकमात्र संरचनात्मक विधि है जो कई तापमानों पर एक ही प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए व्यावहारिक रूप से संभव है।
उच्च तापमान पर विट्रीफिकेशन के लिए प्रमुख कठिनाई वाष्प संघनन को कम करना और पतली बर्फ प्राप्त करना है। यहां हम एसएसओ-केआरआई 12 के हमारे पिछले अध्ययन में उच्च तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। हम मानते हैं कि पाठक या दर्शक पहले से ही क्रायो-ईएम प्रयोगों के लिए समग्र नमूना तैयारी और डेटा प्रोसेसिंग प्रक्रियाओं में अनुभवी हैं और उच्च तापमान से संबंधित पहलुओं पर जोर देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के चरण 1 में, सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज ट्यूब अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और प्रयोग प्रगति पर होने पर नहीं गिरता है। कक्ष में बड़ी संख्या में पानी की बूंदों के संचय के कारण, जो फिल्टर …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक उपयोगी सलाह के लिए थर्मो फिशर साइंटिफिक के डॉ हर्वे रेमिगी को धन्यवाद देते हैं। क्रायो-ईएम प्रयोगएकडेमिया सिनिका क्रायो-ईएम सुविधा (एएससीईएम) में किए गए थे। ASCEM एकेडेमिया सिनिका (ग्रांट नंबर 1) द्वारा समर्थित है। एएस-सीएफआईआई-108-110) और ताइवान प्रोटीन प्रोजेक्ट (अनुदान सं। एएस-केपीक्यू-109-टीपीपी 2)। लेखकों ने नमूना तैयारी के साथ सहायता के लिए सुश्री हुई-जू हुआंग को भी धन्यवाद दिया।
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
