Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM
Summary
Detta dokument ger ett detaljerat protokoll för att förbereda provgaller vid temperaturer så höga som 70 ° C, före doppfrysning för kryo-EM-experiment.
Abstract
Provgallren för kryoelektronmikroskopiexperiment (kryo-EM) framställs vanligtvis vid en temperatur som är optimal för lagring av biologiska prover, mestadels vid 4 °C och ibland vid rumstemperatur. Nyligen upptäckte vi att proteinstrukturen som löses vid låg temperatur kanske inte är funktionellt relevant, särskilt för proteiner från termofila arkéer. Ett förfarande utvecklades för att framställa proteinprover vid högre temperaturer (upp till 70 °C) för kryo-EM-analys. Vi visade att strukturerna från prover framställda vid högre temperaturer är funktionellt relevanta och temperaturberoende. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av provgaller vid hög temperatur, med 55 °C som exempel. I experimentet användes en förglasningsapparat som modifierats med hjälp av ytterligare ett centrifugrör, och proverna inkuberades vid 55 °C. De detaljerade procedurerna finjusterades för att minimera ångkondens och få ett tunt lager is på gallret. Exempel på framgångsrika och misslyckade experiment ges.
Introduction
Kryo-EM-tekniken för att lösa strukturerna i proteinkomplex har fortsatt att förbättras, särskilt i riktning mot att erhålla högupplösta strukturer 1,2. Under tiden har landskapet för dess tillämpning också utvidgats genom att variera provförhållandena såsom pH eller ligander före förglasningsprocessen3, vilket innebär beredning av provgaller följt av doppfrysning 4,5. Ett annat viktigt villkor är temperaturen. Även om kryo-EM-experiment, som röntgenkristallografi, utförs vid låga temperaturer, återspeglar strukturen som löses av kryo-EM strukturen vid lösningstillståndet före förglasning. Fram till nyligen använder majoriteten av kryo-EM-studier med en partikelanalys (SPA) prover som hålls på is (dvs. vid 4 ° C) före förglasning6, även om ett antal studier använder prover vid cirkarumstemperatur 7,8,9,10 eller så högt som 42 ° C 11. I en ny rapport utförde vi temperaturberoende studier av enzymet ketolsyrareduktoisomeras (KARI) från den termofila arkéen Sulfolobus solfataricus (Sso) vid sex olika temperaturer från 4 °C till 70 °C12. Våra studier tyder på att det är viktigt att förbereda provnät vid funktionellt relevanta temperaturer och att kryo-EM är den enda strukturella metoden som är praktiskt genomförbar för att lösa strukturen hos samma proteinkomplex vid flera temperaturer.
Den stora svårigheten för förglasning vid höga temperaturer är att minimera ångkondens och uppnå tunn is. Här rapporterar vi det detaljerade protokollet som används för att förbereda provnät vid höga temperaturer i vår tidigare studie av Sso-KARI 12. Vi antar att läsarna eller tittarna redan har erfarenhet av de övergripande provberednings- och databehandlingsförfarandena för kryo-EM-experiment och betonar de aspekter som är relevanta för hög temperatur.
Protocol
Representative Results
Discussion
I steg 1 i protokollet, se till att centrifugröret har installerats väl och inte faller när experimentet pågår. På grund av ackumuleringen av ett stort antal vattendroppar i kammaren, vilket kan förändra filterpapperets adsorptionskapacitet, rekommenderas att den totala tiden för experimentet inte får överstiga 30 minuter efter att förglasningsapparatkammaren nådde jämviktstemperaturen. Om driftstiden överstiger 30 minuter måste operatören byta ut filterpapperet och vänta på att kabinen balanserar temp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Hervé Remigy från Thermo Fisher Scientific för användbara råd. Kryo-EM-experimenten utfördes vid Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM stöds av Academia Sinica (bidrag nr. AS-CFII-108-110) och Taiwan Protein Project (bidrag nr. AS-KPQ-109-TPP2). Författarna tackar också Hui-Ju Huang för hjälpen med provberedningen.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
