Summary
Este artículo presenta un método único para analizar las interacciones huésped-microbioma utilizando un nuevo sistema de cultivo de órganos intestinales para experimentos ex vivo.
Abstract
La estructura del tejido intestinal facilita interacciones cercanas y mutualistas entre el huésped y la microbiota intestinal. Estas conversaciones cruzadas son cruciales para mantener la homeostasis local y sistémica; los cambios en la composición de la microbiota intestinal (disbiosis) se asocian con una amplia gama de enfermedades humanas. Los métodos para diseccionar las interacciones huésped-microbiota abarcan una compensación inherente entre la preservación de la estructura fisiológica del tejido (cuando se utilizan modelos animales in vivo) y el nivel de control sobre los factores del experimento (como en los sistemas simples de cultivo celular in vitro). Para abordar esta compensación, Yissachar et al. desarrollaron recientemente un sistema de cultivo de órganos intestinales. El sistema conserva una construcción ingenua del tejido del colon y mecanismos celulares y también permite un control experimental estricto, facilitando experimentaciones que no se pueden realizar fácilmente in vivo. Es óptimo para diseccionar respuestas a corto plazo de varios componentes intestinales (como elementos epiteliales, inmunológicos y neuronales) a perturbaciones luminales (incluidos microbios anaeróbicos o aeróbicos, muestras de microbiota completa de ratones o humanos, medicamentos y metabolitos). Aquí, presentamos una descripción detallada de un protocolo optimizado para el cultivo de órganos de múltiples fragmentos intestinales utilizando un dispositivo de cultivo intestinal hecho a medida. Las respuestas del huésped a las perturbaciones luminales se pueden visualizar mediante tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido o fragmentos de tejido de montaje completo, hibridación fluorescente in situ (FISH) o imágenes de lapso de tiempo. Este sistema admite una amplia gama de lecturas, incluida la secuenciación de próxima generación, la citometría de flujo y varios ensayos celulares y bioquímicos. En general, este sistema de cultivo de órganos tridimensionales admite el cultivo de tejidos intestinales grandes e intactos y tiene amplias aplicaciones para el análisis de alta resolución y la visualización de las interacciones huésped-microbiota en el entorno intestinal local.
Introduction
El intestino es un órgano altamente complejo que contiene una amplia gama de tipos de células (células epiteliales, células del sistema inmune, neuronas y más) organizadas en una estructura particular que permite a las células interactuar y comunicarse entre sí y con el contenido luminal (microbiota, alimentos, etc.) 1. Actualmente, la caja de herramientas de investigación disponible para analizar las interacciones huésped-microbiota incluye cultivos celulares in vitro y modelos animales in vivo 2. Los modelos animales in vivo proporcionan una construcción fisiológica del tejido3 pero con un control experimental deficiente y una capacidad limitada para manipular las condiciones del experimento. Los sistemas de cultivo in vitro, por otro lado, utilizan células primarias o líneas celulares que se pueden complementar con microbios4,ofreciendo un control estricto sobre los parámetros del experimento, pero carecen de la complejidad celular y la arquitectura del tejido. Los ensayos in vitro modernos permiten el uso avanzado de muestras de tejido humano sanas y patológicas, como organoides epiteliales derivados de fuentes de ratón ohumanas 5,6,y muestras que imitan el microambiente de la mucosa7. Otro ejemplo es el ensayo 'gut on a chip', que incluye la línea celular epitelial colónica humana (Caco2), la matriz extracelular y los canales microfluídicos para imitar la condición fisiológica del invariante intestinal8. Sin embargo, por muy avanzadas e innovadoras que puedan ser las muestras in vitro, no mantienen una arquitectura tisular normal ni una composición celular ingenua.
Para abordar eso, Yissachar et al. desarrollaron recientemente un sistema de cultivo de órganos ex vivo 9 (Figura 1)que mantiene intactos los fragmentos intestinales ex vivo,beneficiándose de las ventajas de los modelos in vivo e in vitro. Este sistema de cultivo de órganos intestinales ex vivo se basa en un dispositivo de cultivo personalizado que admite un cultivo multiplexado de seis tejidos del colon, lo que permite examinar las entradas experimentales en condiciones comparables mientras se controlan las entradas y salidas del sistema. Trabajos recientes han demostrado que este sistema es valioso para analizar las respuestas intestinales a bacterias intestinales individuales9,muestras enteras de microbiota humana10 y metabolitos microbianos11. Este sistema permite, por primera vez, el estudio de estas interacciones tempranas huésped-microbiota con un alto nivel de control sobre los componentes huésped, microbianos y ambientales. Además, permite monitorizar y manipular el sistema a lo largo del experimento, en tiempo real.
Figura 1: Esquemas del dispositivo de cultivo intestinal. Un fragmento de tejido intestinal entero está unido a los puertos de salida y entrada de la cámara (arriba), con bombas que regulan el flujo medio dentro del lumen y en la cámara media externa. Todo el dispositivo (parte inferior) contiene 6 cámaras de este tipo. Esta cifra ha sido modificada a partir de Yissachar et al. 2017. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal aprobadas por el comité de ética para el bienestar animal.
1. Preparación del experimento
- Fabricación del dispositivo de cultivo de órganos intestinales (3 días)
- Usando una impresora 3D, imprima los moldes de plástico reutilizables para el dispositivo de cultivo de órganos (el dispositivo tiene 6 pozos, con 24 orificios pequeños y grandes, y para la tapa de la cubierta del dispositivo) (archivos 3D adjuntos).
NOTA: Estos moldes de plástico se pueden utilizar para la fabricación de numerosos dispositivos. - Inserte las agujas de extremo romo (22 G y 18 G) en la posición adecuada dentro del molde del dispositivo y funda aproximadamente 20 g de mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) (relación de peso 1:10, base a catalizador) para un juego del dispositivo y la tapa.
- Coloque los moldes en una cámara de vacío durante 30 minutos, para eliminar las burbujas de aire de la mezcla PDMS.
- Incubar los moldes a 55 °C durante la noche, para completar la polimerización de PDMS.
- Cuando se configure el PDMS, saque las agujas del molde y suelte cuidadosamente el dispositivo de cultivo y la tapa de los moldes de plástico.
- Elimine los residuos de PDMS del contorno del pozo con una cuchilla quirúrgica. Coloque el dispositivo PDMS y la cubierta del dispositivo en un vidrio de cubierta (micro portaobjetos de 75 mm x 50 mm) con adhesivo de silicio no tóxico y deje que las piezas se fijen durante la noche (aplique el pegamento en el lado liso del dispositivo).
- Inserte doce agujas de 22 G para el lumen y doce agujas de 18 G para el pozo. Fije todas las agujas en su lugar con silicona y déjelo colocar durante la noche. Inserte dos agujas de 18 G en la tapa de la cubierta para un flujo de aire adecuado dentro y fuera del dispositivo de cultivo de órganos intestinales.
- Revise todas las agujas en busca de fugas con una jeringa llena de agua. Verifique que no haya fugas de los pozos llenando los pozos con agua.
- Coloque dos nudos quirúrgicos en cada aguja de 22 G que se conectará al colon. Coloque el dispositivo y la tapa en una bolsa de papel para autoclave y esterilize en un autoclave.
- Usando una impresora 3D, imprima los moldes de plástico reutilizables para el dispositivo de cultivo de órganos (el dispositivo tiene 6 pozos, con 24 orificios pequeños y grandes, y para la tapa de la cubierta del dispositivo) (archivos 3D adjuntos).
- Medio de cultivo (0,5 h)
- En una campana biológica, mezcle lo siguiente (en tubo de 50 ml): 37 ml del medio modificado de Dulbecco (IMDM) de Iscove, 10 ml de reemplazo sérico KSR, 1 ml de suplemento de B27, 0,5 ml de suplemento de N2, 0,5 ml de tampón HEPES de 1 M y 0,5 ml de aminoácidos no esenciales.
- Filtrar y conservar el medio completo a 4 °C.
- Preparación de tubos y herramientas quirúrgicas
- Corte la longitud adecuada de los tubos para el lúmen de entrada, el pozo de entrada, el lumen de salida y el pozo de salida (12 tubos cortos y 12 tubos largos). Conecte un adaptador apropiado a cada lado del tubo.
- Prepare las herramientas quirúrgicas: tijeras rectas, 4 veces las forrórceps delgadas y 2 veces las afiladas.
- Coloque los tubos y las herramientas quirúrgicas en una bolsa de papel de autoclave y esterilízcalos con un autoclave.
- Prepare la entrada luminal (estimulación deseada: bacterias, heces, medicamentos, etc.).
- Antes del experimento, determinar la carga bacteriana del cultivo bacteriano, mediante diluciones seriadas12,y cultivo en condiciones aeróbicas y/o anaeróbicas.
- Después de calcular la carga bacteriana, diluya los cultivos bacterianos en un medio de cultivo de tejidos estériles para obtener la concentración bacteriana requerida. Para muestras fecales, filtre con un colador de 100 μm.
NOTA: Para la estimulación no bacteriana (fármacos, metabolitos, etc.), diluya la sustancia a la concentración requerida utilizando el medio de cultivo intestinal.
2. Preparación de la configuración del experimento
- Dentro de la incubadora de cultivo de órganos, encienda la unidad de calentador y configúntela a 37 ° C.
- Configure las bombas, así como las jeringas de entrada y salida.
- Entrada de medio de cultivo de tejidos
- En una campana de flujo biológico o laminar, llene las jeringas del pozo de entrada con un medio de cultivo completo. El volumen final depende de la duración del experimento y del caudal; generalmente 1 ml / h más medio adicional para purga.
- Conecte los tubos a las jeringas con el adaptador Luer-lock. Coloque las jeringas llenas en las bombas de jeringa.
- Purgue las jeringas de entrada. Asegúrese de que el medio del pozo fluya desde todos los tubos hacia un vaso de desecho.
- Entrada luminal
- Llene las jeringas de entrada luminal con tratamiento de estimulación (bacterias, medicamentos, etc.). El volumen depende de la duración del experimento y del caudal (generalmente 30 μL/h más medio adicional para purga).
- Conecte los tubos a las jeringas con el adaptador Luer-lock. Coloque las jeringas llenas en las bombas de jeringa.
- Purgar jeringas de entrada. Asegúrese de que la estimulación fluya fuera de todos los tubos hacia un vaso de desecho. Tenga cuidado de no contaminar los diferentes estímulos.
- Salidas
- Coloque las jeringas vacías en las bombas de jeringa de salida (configure el modo de bomba en "retirada").
- Configuración del dispositivo
- Establezca el regulador que controla la mezcla de gases (95% O2 + 5% CO2)para un flujo suave y mínimo.
- Examine el dispositivo en una campana laminar.
- Enjuague las agujas del dispositivo con IMDM estéril para lavar las agujas.
- Añadir 500 μL de medio de cultivo estéril en cada pozo del dispositivo.
- Preparación para la disección de tejidos
- Coloque las herramientas quirúrgicas estériles dentro de la capucha laminar.
- Llene una jeringa de 10 ml con IMDM estéril y conecte una aguja estéril (autoclave) de 22 G de extremo romo para el enrojecimiento del colon.
3. Cultivos de órganos
- Sacrificio de ratones y disección de tejidos
- En una capucha laminar, sacrifica ratones de 12-14 días de edad por decapitación. Rocíe los ratones con 70% de etanol y coloque los ratones en una placa de plástico.
- Usando tijeras y pórceps afilados, diseccione al ratón y saque el tracto digestivo desde el estómago hasta el ano cortando toda la grasa y los tejidos conectivos. Corte el colon y colóquelo en un plato nuevo.
NOTA: Minimice el contacto con el tejido del colon. No toque la parte media del tejido del colon. Sostenga el tejido suavemente y solo en los bordes del tejido.
- Enjuague y lavado de colon
- Bajo un microscopio de disección, enjuague suavemente el contenido del colon con IMDM estéril (en el lado proximal) con la jeringa de 10 ml preparada (paso 2.7.2). Después de extraer las heces del tejido intestinal, coloque el colon en una nueva placa de 6 pozos llena de 0.5 ml de IMDM estéril.
- Conexión de los dos puntos al dispositivo
- Tome el pañuelo y conéctelo cuidadosamente a la aguja de 22 G y haga un lazo apretado con los dos hilos. En este punto, es imperativo mantener la orientación correcta del colon al flujo de lúmenes (proximal = entrada, distal = salida). Repita los pasos 3.2-3.3 para los 6 tejidos.
- Verifique que los bloqueos Luer de la aguja de entrada estén vacíos del medio. Si no, vacíalos. Agregue estimulaciones a la aguja de entrada Luer lock (para evitar la entrada de burbujas de aire en el lumen). Repita este paso para cada colon con la estimulación adecuada.
- Compruebe que todos los tejidos estén conectados y coloque la tapa de la cubierta encima del dispositivo.
- Conexión del dispositivo de cultivo de órganos a las bombas
- Coloque el dispositivo en la cámara de temperatura controlada precalentada (37 °C).
- Conecte el flujo de gas
- Conecte el adaptador de gas a la tapa de la cubierta con la aguja de entrada adecuada.
- Conecte los tubos de entrada y salida al dispositivo.
NOTA: Conecte el lado del colon proximal a las tinas de entrada.
- Purgar el lumen con las entradas de estimulación.
- Fluya suavemente la estimulación luminal a través del intestino y verifique el flujo medio en los tubos de salida.
- Lavar el medio externo.
- Lave el medio externo 3 veces (configure las bombas a una velocidad de 600 μL / min tanto para el pozo de entrada como para el de salida). Cada lavado dura 1 minuto (comenzando por vaciar el pozo).
- Comience el experimento.
- Arranque las bombas a las siguientes velocidades:
Caudal: lumen: entrada- 30 μL/h, salida- 35 μL/h
Medio externo: entrada- 1000 μL/h, salida- 950 μL/h
NOTA: El tiempo del experimento puede variar entre 30 min y 24 h.
- Arranque las bombas a las siguientes velocidades:
- Fin del experimento (hasta 24 h para cultivos de órganos de colon)
- Desconecte todos los tubos del dispositivo.
- Desconecte los tejidos de las agujas y continúe con las lecturas deseadas.
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Representative Results
El sistema de cultivo de órganos intestinales mantiene la viabilidad del tejido ex vivo. La evaluación de la viabilidad del tejido se realizó durante todo el período de cultivo. Los fragmentos de tejido del colon se incubaron en el sistema de cultivo de órganos intestinales y se fijaron después de un cultivo de 2/12/24 h. La integridad de la capa de células epiteliales intestinales (IEC) se validó mediante tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos E-cadherina y citoqueratina-18. Asimismo, se detectaron células caliciformes llenas de moco en el epitelio colónico y secreción de moco dentro de la luz, así como la proliferación de IEC en las criptas colónicas, como lo indica la tinción de Ki-67(Figura 2). Estos resultados y otros9 muestran que el sistema de cultivo intestinal mantiene la función intestinal y la estructura ex vivo.
La rápida respuesta transcripcional del huésped fue desencadenada por la colonización intestinal con bacterias filamentosas segmentadas (SFB). La colonización por dos microbios intestinales inmunomoduladores diferentes se utilizó para examinar los eventos iniciales inducidos en el intestino. El microbio primario fue la bacteria filamentosa segmentada (SFB) que previamente se demostró que induce la diferenciación de la célula Th17 en el intestino delgado13. Los ratones SPF SFB negativos fueron sacrificados y los segmentos del intestino delgado (SI) (íleon) fueron diseccionados y conectados al sistema de cultivo de órganos intestinales. Como SFB es difícil de cultivar in vitro14,los cultivos de órganos se infundieron con una suspensión de gránulos fecales de ratones monocolonizados SFB15 o gránulos fecales de ratones GF como control. SFB indujo Th17 a través de la adherencia al epitelio intestinal13,16. Por lo tanto, se requirió la evaluación de la localización espacial de SFB temprano después de la colonización ex vivo del tejido intestinal. Como se muestra en(Figura 3a),los filamentos SFB típicos se detectaron en estrecha asociación con las vellosidades SI utilizando hibridación fluorescente in situ (FISH), 2 h después de la introducción de SFB. Adicionalmente, una microscopía electrónica de transmisión presentó SFB dentro de unas pocas micras del borde del pincel del epitelio SI (Figura 3b). En ese momento, Yissachar et al. examinaron si la asociación primaria de SFB con el epitelio del intestino delgado activaba una respuesta transcripcional en el tejido. Se produjeron perfiles de expresión génica de muestras de tejido entero, por triplicado, 2 h después de la infusión con SFB. Los cultivos de control se infundieron con suspensiones fecales de ratones monocolonizados con GF o B.fragilis(como control no inductor de Th17). La Figura 3c muestra que los cambios persuadidos por SFB fueron principalmente de pequeña amplitud, en comparación con el control GF.
Figura 2: El sistema de cultivo de órganos intestinales mantiene la viabilidad tisular ex vivo. Tinción por inmunofluorescencia de Mucina-2 y Citoqueratina-18 (arriba), E-cadherina (centro) y Ki-67 (abajo). Imágenes confocales de tejidos de colon recién diseccionados y tejidos cultivados durante 2/12/24 h en el dispositivo de cultivo de órganos intestinales. Barra de escala, 40 mm. Esta cifra ha sido modificada a partir de Yissachar et al. 2017. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Asociación mucosa y desencadenamiento transcripcional rápido de una firma típica por SFB. (A, B) SFB se asocia con el epitelio intestinal después de 2 h en el segmento de intestino delgado cultivado visualizado por (A) FISH con una sonda específica de SFB (rojo) o (B) microscopía electrónica. (C) Inducción de la expresión génica intestinal por SFB. Los cultivos de órganos SI se infundieron con microbios que contenían sobrenadante de heces de ratones monocolonizados SFB o controles de GF y se cultivaron durante 2 h antes del perfil de microarrays de la expresión génica en todo el tejido. Modificaciones en la expresión génica en una "parcela de volcán" que compara cultivos infundidos con SFB o GF. Las transcripciones reguladas hacia arriba o hacia abajo por SFB en todo el SI in vivo se resaltan (rojo y azul, respectivamente). Esta cifra ha sido modificada a partir de Yissachar et al. 2017. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo describe un protocolo optimizado para cultivos de órganos intestinales ex vivo que Yissachar et al. han desarrollado recientemente (datos publicados9 y no publicados). El sistema de cultivo de órganos intestinales admite el cultivo multiplexado de fragmentos intestinales intactos mientras mantiene el flujo luminal. Proporciona un control total sobre el entorno intra y extra-luminal (incluyendo la dosis de estimulación, el tiempo de exposición y el caudal) y preserva la estructura ingenua del tejido intestinal y su complejidad celular9.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen los siguientes. (1) La disección tisular debe realizarse en un tiempo mínimo, y muy suavemente, para minimizar el daño tisular (que puede conducir a la muerte celular y la fuga de contenido luminal a través de los sitios dañados). (2) Mantenga la orientación del tejido en el dispositivo conectando el puerto de entrada al colon proximal y el puerto de salida al extremo distal del colon. (3) Después de conectar el intestino al dispositivo, asegúrese de que el tejido esté intacto y que los puntos de conexión a los puertos intra-luminales no estén goteando. Eso mantendrá la estimulación bacteriana dentro de la luz y no contaminará el ambiente externo, que debe mantenerse lo más estéril posible. (4) Los tejidos deben diseccionarse de ratones de 12 a 14 días de edad. En ratones más jóvenes, el colon es más pequeño y suave y requiere diferentes condiciones de manejo y cultivo (datos no mostrados). Los tejidos de ratones más viejos son significativamente más grandes, lo que afecta la viabilidad del tejido y la duración del cultivo. (5) Para reducir la variabilidad en las respuestas intestinales, utilice tejidos diseccionados de ratones camados en cada dispositivo (reduzca la variabilidad en la composición endógena del microbioma, similar al diseño experimental in vivo).
Las limitaciones actuales del sistema de cultivo intestinal incluyen las siguientes. (1) Cada dispositivo contiene seis canales, que limitan el número de condiciones diferentes que se pueden probar en un experimento. (2) Los tejidos deben diseccionarse de ratones de 12 a 14 días de edad (ver arriba); por lo tanto, el sistema inmune entérico y la barrera epitelial no han alcanzado la maduración final. (3) La viabilidad tisular en cultivo se ve afectada si la duración del cultivo supera las 24 h (para los tejidos del colon, menos para el intestino delgado). (4) Este protocolo requiere la compra de equipos especiales (es decir, bombas de jeringa, incubadoras a medida y otros).
En resumen, el sistema de cultivo de órganos intestinales sirve como un paso experimental intermedio entre ensayos in vitro simples y experimentos complejos in vivo. Ofrece una combinación de alta capacidad de control (como en ensayos in vitro simples) con preservación de la fisiología intestinal (se asemeja mucho a los modelos in vivo), una ventaja significativa y única de este sistema. Esta ventaja facilita las experimentaciones que no se pueden realizar fácilmente en ratones (es decir, el seguimiento de las respuestas tempranas de las células que residen en el intestino en alta resolución temporal). Recientemente, nos ha permitido descubrir algunas conexiones sorprendentes entre el microbioma intestinal (microbios específicos y microbiota entera derivada del ser humano) y los sistemas inmunológico y nervioso intestinal9,10. En general, esta herramienta poderosa y única se puede combinar con una amplia gama de técnicas de lectura (incluida la secuenciación de próxima generación, imágenes, clasificación celular y más) y proporciona algunos conocimientos novedosos sobre las interacciones huésped-microbioma en la salud y la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros pasados y presentes del laboratorio de Yissachar por sus valiosas contribuciones en la optimización del protocolo del sistema de cultivo de órganos intestinales. Agradecemos a Yael Laure por la edición crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencia de Israel (subvención No. 3114831), la Fundación de Ciencia de Israel - Programa Conjunto del Instituto Broad (subvención No. 8165162) y el Fondo Gassner para la Investigación Médica, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| 18 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Gauge Blunt Needle | Mcmaster | 75165a758 | |
| All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone | DAP | 688 | |
| Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves | AAAD4021 | ||
| Glass Slide 1 mm Thick | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini Incubator im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vacuum PUMP | VI-412711 | ||
| Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow | Polydimethylsiloxane, PDMS | |
| Tubing | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Materials: z-ultrat | Zortrax | ||
| Medium | |||
| B27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| HEPES Buffer (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium with Phenol Red (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Knock-Out Serum | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Non Essential Amino Acid (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Surgical Tools | |||
| Large Scissors | Aseltech | 11-00-10 | |
| Sharp Forceps | F.S.T | 11297-10 | |
| Silk Braided Surgical Thread | SMI | 8010G | |
| Straight Scissors | F.S.T | 14091-09 | |
| Thin Forceps | F.S.T | 11051-10 | |
| Organ System | |||
| 0.1 µm Filter | Life Gene | ||
| 0.22 µm Filter | Life Gene | ||
| 5 mL Luer Lock Syringe | B-D | 309649 | |
| Greenough Stereo Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Recirculating Precision Air Heater "CUBE" | CUBE-2-LIS | ||
| Syringe Pump | new era pump systems inc | nep-ne-1600-em |
References
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