Summary

Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis

Published: July 21, 2021
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Summary

Lorsque les protéines précurseurs de la famille ß du facteur de croissance transformant sont exprimées ectopiquement dans les embryons de Xenopus laevis, elles se dimérisent, se clivent et sont sécrétées dans le blastocoele, qui commence à la fin de la blastula au stade précoce de gastrula. Nous décrivons une méthode d’aspiration des produits de clivage de la cavité blastocoèle pour l’analyse immunoblot.

Abstract

Les deux bras de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß), représentés respectivement par les ligands Tgfß/Nodal ou de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp), jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie adulte. Les membres de la famille Tgfß sont fabriqués comme des précurseurs inactifs qui dimérisent et se replient dans le réticulum endoplasmique. Le précurseur est ensuite clivé en fragments de ligand et de prodomaine. Bien que seul le ligand dimérique puisse engager les récepteurs Tgfß et activer la signalisation en aval, il est de plus en plus reconnu que la fraction prodomaine contribue à l’activité du ligand. Cet article décrit un protocole qui peut être utilisé pour identifier les produits de clivage générés lors de l’activation des protéines précurseurs de Tgfß. Les précurseurs de Tgfß codant pour l’ARN sont d’abord microinjectés dans les embryons de X. laevis. Le lendemain, les produits de clivage sont collectés à partir de la blastocoele d’embryons au stade gastrula et analysés sur des transferts Occidentaux. Ce protocole peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques.

Introduction

Les membres de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß) sont synthétisés sous forme de protéines précurseurs dimérisées inactives. Les précurseurs sont ensuite clivés par les membres de la famille des proprotéines convertases (PC), soit dans la voie sécrétoire, soit à l’extérieur des cellules. Cela crée un dimère de ligand actif lié au disulfure et deux fragments de prodomaine1. Bien que l’on sache depuis plus de 30 ans que le prodomaine des précurseurs de la famille Tgfß est nécessaire pour générer un ligand2actif, la compréhension de la façon dont les prodomaines contribuent à la fonction du ligand est incomplète.

Bien que la compréhension du processus d’activation protéolytique des membres de la famille Tgfß reste incomplète, il y a un intérêt croissant à comprendre quel(s) motif(s) de consensus PC sont clivés in vivo,si le clivage se produit dans un compartiment subcellulaire ou extracellulaire spécifique, et si le prodomaine reste covalent ou non associé au ligandclivé 3. Plusieurs études ont montré que le prodomaine non seulement guide le repliement des ligands avant leclivage4,5,mais peut également influencer la stabilité du facteur de croissance et l’amplitude d’action6,7,8,9,conduire la formation d’homodimères ou d’hétérodimères10,ancrer le ligand dans la matrice extracellulaire pour maintenir la latence du ligand11et, dans certains cas, fonctionner comme un ligand à part entière pour activer les hétérologues. signalisation12. Les mutations ponctuelles hétérozygotes au sein du prodomaine de nombreux membres de la famille Tgfß sont associées à des anomalies oculaires, osseuses, rénales, squelettiques ou autres chez l’homme3. Ces résultats soulignent le rôle critique du prodomaine dans la génération et le maintien d’un ligand actif et soulignent l’importance d’identifier et de déchiffrer le rôle des produits de clivage développés au cours de la maturation protéolytique des précurseurs de la famille Tgfß.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour aspirer les produits de clivage générés lors de la maturation des précurseurs de la famille Tgfß à partir du blastocoèle des embryons de X. laevis, puis les analyser sur des immunoblots. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si un ou plusieurs motifs de consensus PC dans une protéine précurseur sont clivés in vivo10,13, identifier le ou les PC endogènes qui clivent chaque motif 13,14, comparer la formation in vivo d’homodimères de la famille Tgfß par rapport aux hétérodimères10 ou analyser si les mutations ponctuelles associées à la maladie humaine dans les précurseurs Tgfß ont un impact sur leur capacité à former des ligands dimériques fonctionnels.

Protocol

Toutes les procédures décrites sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Utah. Les grenouilles sont hébergées dans une installation approuvée par l’IACUC. Les grenouilles mâles sont euthanasiées par immersion dans la tricaïne suivie d’une coupe du ventricule du cœur. Les grenouilles femelles sont hébergées dans le laboratoire pendant un maximum de 24 heures après l’induction hormonale du frai pour permettre la collecte des œufs, puis retourn?…

Representative Results

L’objectif de l’expérience décrit ci-dessous était de déterminer si Bmp4 et Bmp7 forment des hétérodimères (dimères composés d’un ligand Bmp4 et d’un ligand Bmp7), des homodimères (composés de deux ligands Bmp4 ou deux ligands Bmp7), ou un mélange de chacun lorsqu’ils sont co-exprimés dans X. laevis. Les données présentées à la figure 2 sont extraites d’une étude publiée précédemment10. La figure 2A</stron…

Discussion

Les principaux avantages du protocole décrit ici sont qu’il peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques. Un autre avantage est qu’il permet d’analyser les protéines marquées par épitope et de contourner ainsi la pénurie d’anticorps disponibles dans le commerce qui reconnaissent la plupart des prodomaines de la famille Tgfß. Bien qu’il soit également possible d’ana…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Mary Sanchez pour les excellents soins aux animaux. La recherche des auteurs est soutenue par le National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health (NIH / NICHD) subventions R01HD067473-08 et R21 HD102668-01 et par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subvention R01DK128068-01.

Materials

ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

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Cite This Article
Kim, H., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

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