Análise do Fator de Crescimento Transformador ß Produtos de Decote Familiar Secretados Na Blastocoele de Embriões Xenopus laevis
Summary
Quando as proteínas precursoras do Fator de Crescimento Transformador são expressas em embriões xenopus laevis, elas escurecem, são cortadas e são secretadas na blastocoele, que começa no final da blastula até o estágio gastrula inicial. Descrevemos um método para aspirar produtos de decote da cavidade blastocoele para análise de imunoblot.
Abstract
Os dois braços da superfamília Fator de Crescimento Transformador ß (Tgfß), representados por ligantes de proteína morfogenética Tgfß/Nodal ou Bone (Bmp), respectivamente, desempenham papéis essenciais no desenvolvimento embrionário e na homeostase adulta. Membros da família Tgfß são feitos como precursores inativos que escurecem e dobram dentro do ânticulo endoplasmático. O precursor é posteriormente cortado em fragmentos de ligante e prodomínio. Embora apenas o ligante dimeric possa engajar receptores Tgfß e ativar a sinalização a jusante, há um reconhecimento crescente de que a moiety prodomínio contribui para a atividade de ligante. Este artigo descreve um protocolo que pode ser usado para identificar produtos de decote gerados durante a ativação das proteínas precursoras de Tgfß. Os precursores de RNA são primeiro microinjetados em embriões X. laevis. No dia seguinte, os produtos de decote são coletados da blastocoele de embriões do estágio gastrula e analisados em manchas ocidentais. Este protocolo pode ser concluído relativamente rapidamente, não requer reagentes caros e fornece uma fonte de produtos concentrados de decote Tgfß em condições fisiológicas.
Introduction
Os membros da superfamília Fator de Crescimento Transformador ß (Tgfß) são sintetizados como proteínas precursoras inativas e dimerizadas. Os precursores são então cortados por membros da família proproteína convertase (PC), seja dentro da via secreta ou fora das células. Isso cria um mais fraco ligante ativo e ligado a dissulfeto e dois fragmentos de prodomínio1. Embora seja sabido há mais de 30 anos que o prodomínio dos precursores da família Tgfß é necessário para gerar um ligante ativo2, o entendimento de como os prodomínios contribuem para a função ligante é incompleto.
Embora o entendimento do processo de ativação proteolítica dos membros da família Tgfß permaneça incompleto, há um interesse crescente em entender quais motivos de consenso do PC são cleaved in vivo, se o decote ocorre em um compartimento subcelular específico ou extracelular, e se o prodomínio permanece covalentemente ou não covalentemente associado à ligadura3. Vários estudos têm demonstrado que o prodomínio não só guia a dobra de ligadura antes do decote4,5, mas também pode influenciar a estabilidade do fator de crescimento e a faixa de ação6,7,8,9, conduzir a formação de homodimers ou heterodimers10, ancorar o ligante na matriz extracelular para manter a latência de ligadura11, e em alguns casos, funcionar como um ligante em seu próprio direito de ativar heterologos sinalização12. Mutações heterozygous no prodomínio de muitos membros da família Tgfß estão associadas a olhos, ossos, rins, esqueléticos ou outros defeitos em humanos3. Esses achados destacam o papel crítico do prodomínio na geração e manutenção de um ligante ativo e ressaltam a importância de identificar e decifrar o papel dos produtos de decote desenvolvidos durante o amadurecimento proteolítico dos precursores da família Tgfß.
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para aspirar produtos de decote gerados durante a maturação de precursores da família Tgfß a partir da blastocoele de embriões X. laevis e, em seguida, analisá-los em imunoblots. Este protocolo pode ser usado para determinar se um ou mais motivos de consenso do PC em uma proteína precursora são cortados in vivo10,13, identificar os PC(s) endógenos que apertam cada motivo13,14, compare a formação in vivo de homodimers da família Tgfß versus heterodimers10 ou analise se mutações de pontos associadas a doenças humanas em precursores de Tgfß afetam sua capacidade de formar ligantes diméricos funcionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
As principais vantagens do protocolo descrito aqui são que ele pode ser concluído relativamente rapidamente, não requer reagentes caros e fornece uma fonte de produtos concentrados de decote Tgfß em condições fisiológicas. Outra vantagem é que permite analisar proteínas marcadas por epítope e, assim, contornar a escassez de anticorpos disponíveis comercialmente que reconhecem a maioria dos prodomínios da família Tgfß. Embora também seja possível analisar o decote das proteínas precursoras tgfß marcadas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mary Sanchez pelo excelente cuidado com os animais. A pesquisa dos autores é apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH/NICHD) que concede R01HD067473-08 e R21 HD102668-01 e pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK/NIH) doação R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
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