Bestemmelse af trepartsinteraktion mellem to monomerer af en MADS-box transskriptionsfaktor og et calciumsensorprotein ved BiFC-FRET-FLIM Assay

Summary

Her præsenterer vi, en metode til at visualisere ternary kompleks dannelse mellem tre proteinpartnere ved hjælp af fluorescerende-tagged proteiner ved BiFC baseret FRET-FLIM assay. Denne metode er værdifuld til undersøgelse af protein-protein interaktion komplekser in vivo.

Abstract

Protein-protein interaktioner er en integreret del af alle biologiske processer i cellerne, da de spiller en afgørende rolle i regulering, vedligeholdelse og ændring af cellulære funktioner. Disse interaktioner er involveret i en bred vifte af fænomener såsom signaltransduktion, patogenrespons, cellecelleinteraktioner, metaboliske og udviklingsmæssige processer. I tilfælde af transskriptionsfaktorer kan disse interaktioner føre til oligomerisering af underenheder, binding i specifikke subcellulære sammenhænge som kernen, cytoplasmaet osv., som igen kan have en dybere virkning på ekspressionen af downstream-generne. Her demonstrerer vi en metode til at visualisere in vivo trepartsinteraktion ved hjælp af Bimolekulær Fluorescens Complementation (BiFC) baseret Förster Resonance Energy Transfer (FRET), der involverer Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM). To af de proteiner, der er udvalgt til denne demonstration, interagerer som BiFC-partnere, og deres rekonstituerede fluorescensaktivitet bruges til at analysere FRET-FLIM med den tredje partner. Fire til fem uger gamle vækstkammerdyrkede Nicotiana benthamiana planter er blevet brugt som model plantesystem til denne demonstration.

Introduction

Protein-protein interaktioner (PPI) danner grundlag for en velfungerende eukaryote celler ved at regulere forskellige metaboliske og udviklingsmæssige processer. Nogle PPI er stabile, mens andre er forbigående. Interaktionerne kan kategoriseres ud fra antallet og typen af medlemmer i interaktionen, f.eks. Identifikation og karakterisering af proteininteraktioner kan føre til en bedre forståelse af proteinfunktioner og reguleringsmæssige netværk.

Transskriptionsfaktorer er proteiner, der er involveret i regulatoriske funktioner. De regulerer hastigheden af transskription af deres downstream gener ved at binde sig til DNA. Sommetider oligomerisering eller dannelse af højere orden komplekser af proteiner er en forudsætning for at udføre deres funktioner². Plant MADS-box transskription faktorer er homeotiske gener, der regulerer forskellige processer såsom blomster overgang, blomster organ udvikling, befrugtning, frø udvikling, senescence, og vegetativ udvikling. De er kendt for at danne højere orden komplekser, der binder sig til DNA^3,4. Undersøgelse ppi netværk blandt transskription faktorer og deres interactors giver indsigt i kompleksiteten underliggende transskription regulering.

Forbigående protein udtryk i Nicotiana benthamiana har været en populær tilgang til at studere protein lokalisering eller protein-protein interaktioner in vivo⁵. BiFC og FRET er metoder til at studere protein-protein interaktioner in vivo ved hjælp af fluorescerende reporter systemer⁶. En kombination af disse to teknikker har vist sig at afsløre samspillet mellem tre proteiner⁷. FRET måles ved hjælp af acceptor photobleaching, sensibiliseret emission, og Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) teknik. FLIM-baserede FRET assay har vist sig som et værktøj, der giver præcis kvantificering og spatiotemporal specificitet til energioverførsel målinger mellem to molekyler baseret på deres fluorescens levetid⁸. FLIM måler den tid, en fluorophore forbliver i en ophidset tilstand, før udsender en foton og er bedre end teknikker, der bruger intensitet målinger alene^9,10. Ud over heterologe systemer som Nicotiana benthamiana og løg epidermal peelinger, nyere rapporter har vist brugen af Arabidopsis rødder og unge risplanter, osv., for in vivo analyse af protein-protein interaktioner under indfødte forhold^11,12.

Bortset fra et passende udtrykssystem er udvælgelsen af interagerende partnere til BiFC- og FRET-analyser også afgørende for succesen af dette eksperiment. PPI blandt partnere , der anvendes i BiFC-konfigurationen , bør valideres ved hjælp af passende kontrolelementer, før de anvendes som konjugeret partner i FRET-eksperimentet¹³. BiFC anvender den strukturelle komplementering af N- og C-terminal dele af fluorescerende protein. En fælles begrænsning i de fleste, hvis ikke alle fluorescerende proteiner, der anvendes i BiFC-analyser, har været selvmonteringen mellem de to afledte ikkefluorescent fragmenter, der bidrager til falsk-positiv fluorescens og reducerer signal-til-støj (S /N) forholdet¹⁴. Den seneste udvikling, herunder punktmutationer eller position til opdeling af fluorescerende protein, har givet anledning til BiFC-par med øget intensitet, højere specificitet, højt S /N-forhold^15,16. Disse fluorescerende proteiner kan også bruges til at udføre BiFC afhængigt af eksperimentets egnethed.

Traditionelt er den fælles fiskeripolitik og YFP blevet brugt som donor og acceptorpar i FRET-eksperimenter¹⁷. Men, YFP eller m-Citrine viste sig at være bedre FRET donorer (når de anvendes med RFP som acceptor) på grund af det høje kvanteudbytte (QY) under den indfødte udtryk for mål proteiner i Arabidopsis rodsystemet. Udvælgelsen af initiativtagere (konstituerende versus indfødte / endogene) og fluorophore spiller også en afgørende rolle i udformningen af en vellykket BiFC-FRET-FLIM eksperiment. Det er vigtigt at bemærke, at FRET-donorernes effektivitet og FRET-pars egnethed har tendens til at ændre sig med ændringen i initiativtageren og det biologiske system, der anvendes til udtryk. QY af fluorophore, som vedrører dens lysstyrke, afhænger af pH, temperatur, og det biologiske system i brug. Vi foreslår, at disse kriterier overvejes grundigt, før du vælger fluorophoreparret til FRET-eksperimentet. Det biologiske system, initiativtagerne og de proteiner, der anvendes til denne protokol, fungerede godt med CFP-YFP fluorophorer til BiFC FRET-FLIM eksperimentet.

I denne undersøgelse inkorporerer vi funktionen af FLIM for at visualisere samspillet mellem tre proteinmolekyler ved hjælp af BiFC-baseret FRET. I denne teknik er to proteiner mærket med split YFP-protein og det tredje protein med cfp. Da vi var interesseret i at studere samspillet mellem en MADS-box protein (M) homodimer med en Calcium sensor protein (C), disse proteiner blev mærket med fluorescerende proteiner i pSITE-1CA og pSITE-3CA vektorer¹⁸. To af de interagerende partnere, i denne analyse, blev mærket med N- og C-terminal dele af YFP i pSPYNE-35S og pSPYCE-35S vektorer¹⁹, og deres interaktion resulterer i rekonstitution af den funktionelle YFP, der fungerer som en FRET acceptor til den tredje interagerende partner, som er mærket med den fælles fiskeripolitik (fungerer som FRET donor) (Figur 1 ). I dette særlige tilfælde er PPI mellem to M-monomerer og mellem M og C blevet valideret ved at udføre BiFC i tre forskellige systemer sammen med gær-to-hybrid-systemet. Disse vektorer blev mobiliseret i Agrobacterium tumifaciens GV3101 stamme ved elektroporation. GV3101-stammen har en afvæbnet Ti plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) med gentamicinresistens²⁰. En p19 Agrobacterium stamme blev tilføjet sammen med alle infiltrationer for at forhindre transgene lyddæmpning²¹. Vi anbefaler, at de tre proteiner også anvendes i modsatte konformationer for at validere trepartsinteraktionerne.

I denne teknik har vi anvendt FLIM, hvor donorens fluorescenslevetid (uudslukket donorlevetid) for det første måles i mangel af en acceptor. Derefter måles dens levetid i acceptorens tilstedeværelse (slukket donorlevetid). Denne forskel i donor fluorescens levetid bruges til at beregne FRET effektivitet, som afhænger af antallet af fotoner udviser en reduktion i fluorescens levetid. Nedenfor er en detaljeret protokol til bestemmelse af dannelsen af etternært kompleks mellem tre proteiner ved forbigående at udtrykke fluorescerende-taggede proteiner i Nicotiana benthamiana og analysere deres interaktion med BiFC-FRET-FLIM.

Protocol

1. Kloning af gener i ind- og destinationsvektorer (figur 2) Forstærke kodning sekvens (CDS) af de gener af interesse (M og C gener i vores tilfælde) af PCR og klone dem i passende indrejse vektorer (f.eks pENTR/D-TOPO vektor; se tabel 1 for vektorer, der bruges i dette eksperiment). Dyrk klonerne på plader, der indeholder antibiotika. Valider kloner, der er udvalgt på antibiotika ved at begrænse fordøjelse…

Representative Results

Denne protokol repræsenterer en optimeret metode til at studere in vivo trepartsprotein-protein interaktioner i planter. Det grundlæggende princip i protokollen er at kombinere to fluorescens-tagged protein-interaktion teknikker, dvs BiFC og FRET, at skabe en analyse til måling af ternary kompleks dannelse mellem tre protein partnere. Her har vi brugt FLIM til at måle FRET-donorpartnerens fluorescenslevetid i FRET-acceptens tilstedeværelse og fravær. En reduktion i donorens fluorescenslevetid var forventet…

Discussion

Denne protokol viser brugen af BiFC-baseret FRET-FLIM-analyse til at fastslå dannelsen af etternært kompleks mellem to monomerer af et MADS-box protein og et calciumsensorprotein. Protokollen er tilpasset fra en rapport fra Y. John Shyu et al., hvor de har udviklet en BiFC-baseret FRET-metode til at visualisere ternary kompleks dannet mellem Fos-Jun heterodimers og NFAT eller p65 ved hjælp af den sensibiliserede emissionsmetode⁷. Tidligere, en tre-fluorophore FRET system blev udviklet af Galper…

Materials

1 ml Syringes without needles	Dispovan	-
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix	Thermo Fischer Scientific	11791020	The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate	Himedia	CMS461
Kanamycin Sulphate	Himedia	MB105
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Thermo Fischer Scientific	K240020	The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase	Thermo Fischer Scientific	F530-S	Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin	Himedia	CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope	Leica	SP8 FALCON	Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Himedia	TC034