Определение трехстороннего взаимодействия между двумя мономерами транскрипционного фактора MADS-бокса и белка датчика кальция методом анализа BiFC-FRET-FLIM
Summary
Здесь мы представляем метод визуализации образования троичного комплекса между тремя белковыми партнерами с использованием флуоресцентных помеченных белков с помощью анализа FRET-FLIM на основе BiFC. Этот метод ценен для изучения белково-белковых комплексов взаимодействия in vivo.
Abstract
Белково-белковые взаимодействия являются неотъемлемой частью всех биологических процессов в клетках, поскольку они играют решающую роль в регулировании, поддержании и изменении клеточных функций. Эти взаимодействия участвуют в широком спектре явлений, таких как сигнальная трансдукция, реакция патогена, взаимодействие клеток с клетками, метаболические процессы и процессы развития. В случае транскрипционных факторов эти взаимодействия могут привести к олигомеризации субъединиц, секвестрации в конкретных субклеточных контекстах, таких как ядро, цитоплазма и т. Д., Что, в свою очередь, может оказать более глубокое влияние на экспрессию нисходящих генов. Здесь мы демонстрируем методологию визуализации трехстороннего взаимодействия in vivo с использованием бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) с использованием флуоресцентной пожизненной визуализации (FLIM). Два белка, выбранных для этой демонстрации, взаимодействуют как партнеры BiFC, и их восстановленная флуоресцентная активность используется для анализа FRET-FLIM с третьим партнером. Четыре-пятинедельные растения Nicotiana benthamiana, выращенные в камере роста, были использованы в качестве модельной системы растений для этой демонстрации.
Introduction
Белково-белковые взаимодействия (ИПП) составляют основу правильного функционирования эукариотических клеток, регулируя различные метаболические процессы и процессы развития. Некоторые ИЦП являются стабильными, в то время как другие носят преходящий характер. Взаимодействия могут быть классифицированы на основе количества и типа членов во взаимодействии, таких как димерные, тримерные, тетрамерные гомомерные и гетеромерные1. Идентификация и характеристика белковых взаимодействий может привести к лучшему пониманию функций белка и регуляторных сетей.
Факторы транскрипции — это белки, которые участвуют в регуляторных функциях. Они регулируют скорость транскрипции своих нисходящих генов, связываясь с ДНК. Иногда олигомеризация или образование белков комплексов высшего порядка является предпосылкой для выполнения их функций2. Факторы транскрипции РАСТЕНИЙ MADS-box представляют собой гомеотические гены, которые регулируют различные процессы, такие как переход флоры, развитие цветочных органов, удобрение, развитие семян, старение и вегетативное развитие. Известно, что они образуют комплексы высшего порядка, которые связываются с ДНК3,4. Изучение сетей PPI среди факторов транскрипции и их интеракторов дает представление о сложности, лежащей в основе транскрипционной регуляции.
Транзиторная экспрессия белка в Nicotiana benthamiana была популярным подходом к изучению локализации белка или белково-белковых взаимодействий in vivo5. BiFC и FRET являются методами изучения белково-белковых взаимодействий in vivo с использованием флуоресцентных репортерных систем6. Было показано, что комбинация этих двух методов раскрывает взаимодействие между тремя белками7. FRET измеряется с использованием акцепторного фотоотбеливания, сенсибилизированного излучения и метода флуоресцентной визуализации (FLIM). Анализ FRET на основе FLIM появился как инструмент, который обеспечивает точную количественную оценку и пространственно-временную специфичность для измерений передачи энергии между двумя молекулами на основе их флуоресцентного времени жизни8. FLIM измеряет время, в течение которого флуорофор остается в возбужденном состоянии до испускания фотона, и лучше, чем методы, которые используют только измерения интенсивности9,10. Помимо гетерологичных систем, таких как Nicotiana benthamiana и луковые эпидермальные пилинги, более поздние отчеты продемонстрировали использование корней Arabidopsis и молодых саженцев риса и т. Д. Для анализа in vivo белково-белковых взаимодействий в нативных условиях11,12.
Помимо подходящей системы выражения, выбор взаимодействующих партнеров для анализов BiFC и FRET также имеет решающее значение для успеха этого эксперимента. PPI среди партнеров, используемых в конфигурации BiFC, должен быть проверен с использованием соответствующих элементов управления перед их использованием в качестве сопряженного партнера в эксперименте FRET13. BiFC использует структурное дополнение N- и C-концевых частей флуоресцентного белка. Общим ограничением в большинстве, если не во всех флуоресцентных белках, используемых в анализах BiFC, была самосборка между двумя производными нефлуоресцентными фрагментами, способствующая ложноположительной флуоресценции и уменьшающая отношение сигнал-шум (S / N)14. Последние разработки, включая точечные мутации или положение расщепления флуоресцентного белка, дали начало парам BiFC с повышенной интенсивностью, более высокой специфичностью, высоким соотношением S/N15,16. Эти флуоресцентные белки также могут быть использованы для проведения BiFC в зависимости от пригодности эксперимента.
Традиционно CFP и YFP использовались в качестве пары донора и акцептора в экспериментах FRET17. Тем не менее, было обнаружено, что YFP или m-цитрин являются лучшими донорами FRET (при использовании с RFP в качестве акцептора) из-за высокого квантового выхода (QY) во время нативной экспрессии целевых белков в корневой системе Arabidopsis. Выбор промоторов (конститутивных и нативных/эндогенных) и флуорофоров также играет решающую роль в разработке успешного эксперимента BiFC-FRET-FLIM. Важно отметить, что эффективность доноров FRET и пригодность пар FRET, как правило, меняются с изменением промотора и биологической системы, используемой для экспрессии. QY флуорофора, который относится к его яркости, зависит от рН, температуры и используемой биологической системы. Мы предлагаем тщательно рассмотреть эти критерии, прежде чем выбирать пару флуорофоров для эксперимента FRET. Биологическая система, промоторы и белки, используемые для этого протокола, хорошо работали с флуорофорами CFP-YFP для эксперимента BiFC FRET-FLIM.
В настоящем исследовании мы включили функцию FLIM для визуализации взаимодействия между тремя белковыми молекулами с использованием FRET на основе BiFC. В этом методе два белка помечаются разделенным белком YFP, а третий белок — CFP. Поскольку мы были заинтересованы в изучении взаимодействия гомодимера белка MADS-box (M) с белком датчика кальция (C), эти белки были помечены флуоресцентными белками в векторах pSITE-1CA и pSITE-3CA18. Два из взаимодействующих партнеров в этом анализе были помечены N- и C-концевыми частями YFP в векторах pSPYNE-35S и pSPYCE-35S19,и их взаимодействие приводит к восстановлению функционального YFP, который действует как акцептор FRET, к третьему взаимодействующему партнеру, который помечен CFP (действуя как донор FRET)(рисунок 1 ). В этом конкретном случае PPI между двумя мономерами M и между M и C был проверен путем выполнения BiFC в трех различных системах вместе с дрожжево-двухгибридной системой. Эти векторы были мобилизованы в штамм Agrobacterium tumifaciens GV3101 путем электропорации. Штамм GV3101 имеет обезоруженную Ti плазмиду pMP90 (pTiC58DT-ДНК) с резистентностью к гентамицину20. Штамм p19 Agrobacterium добавляли вместе со всеми инфильтрациями для предотвращения глушения трансгенов21. Мы рекомендуем, чтобы три белка также использовались в противоположных конформациях для проверки трехсторонних взаимодействий.
В этом методе мы использовали FLIM, где сначала время жизни флуоресценции донора (срок службы неутоленного донора) измеряется при отсутствии акцептора. После этого его срок службы измеряется в присутствии акцептора (закаленный срок жизни донора). Эта разница в времени жизни донорской флуоресценции используется для расчета эффективности FRET, которая зависит от количества фотонов, демонстрирующих сокращение времени жизни флуоресценции. Ниже приведен подробный протокол для определения образования троичного комплекса между любыми тремя белками путем временной экспрессии флуоресцентных помеченных белков в Nicotiana benthamiana и анализа их взаимодействия с помощью BiFC-FRET-FLIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол демонстрирует использование анализа FRET-FLIM на основе BiFC для установления образования троичного комплекса между двумя мономерами белка MADS-box и белка датчика кальция. Протокол адаптирован из отчета Y. John Shyu et al., где они разработали метод FRET на основе BiFC для визуализации …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NB, GG, SB, KC искренне благодарят Комиссию по университетским грантам (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE и Совет по научным и промышленным исследованиям (CSIR) за их исследовательские стипендии. Мы с благодарностью выражаем признательность Департаменту биотехнологии (DBT), правительству Индии, Департаменту науки и техники (DST-FIST), правительству Индии за финансовую поддержку.
Materials
| 1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
| Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
| Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
| Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
References
- Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
- Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. Choose your partners: dimerization in eukaryotic transcription factors. Trends in Biochemical Sciences. 33 (5), 220-229 (2008).
- Arora, R., et al. MADS-box gene family in rice: genome-wide identification, organization and expression profiling during reproductive development and stress. BMC Genomics. 8 (242), (2007).
- Theißen, G., Gramzow, L. Structure and evolution of plant MADS domain transcription factors. Plant Transcription Factors: Evolutionary, Structural and Functional Aspects. , 127-138 (2016).
- Schweiger, R., Schwenkert, S. Protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), (2014).
- Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature Protocols. 3 (11), 1693-1702 (2008).
- Kwaaitaal, M., Keinath, N. F., Pajonk, S., Biskup, C., Panstruga, R. Combined bimolecular fluorescence complementation and förster resonance energy transfer reveals ternary SNARE complex formation in living plant cells. Plant Physiology. 152 (3), 1135-1147 (2010).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1 (2020).
- Long, Y., et al. Optimizing FRET-FLIM labeling conditions to detect nuclear protein interactions at native expression levels in living Arabidopsis roots. Frontiers in Plant Science. 9, 1-13 (2018).
- Burman, N., Chandran, D., Khurana, J. P. A Rapid and highly efficient method for transient gene expression in rice plants. Frontiers in Plant Science. , 11 (2020).
- Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: Recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
- Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends in Biotechnology. 26 (11), 622-630 (2008).
- Kodama, Y., Hu, C. D. An improved bimolecular fluorescence complementation assay with a high signal-to-noise ratio. BioTechniques. 49 (5), 793-803 (2010).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): A 5-year update and future perspectives. BioTechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: Probing Nicotiana benthamiana- Virus Interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20 (7), 740-750 (2007).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant Journal. 40 (3), 428-438 (2004).
- Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science. 5 (10), 446-451 (2000).
- Van Der Hoorn, R. A. L., Rivas, S., Wulff, B. B. H., Jones, J. D. G., Joosten, M. H. A. J. Rapid migration in gel filtration of the Cf-4 and Cf-9 resistance proteins is an intrinsic property of Cf proteins and not because of their association with high-molecular-weight proteins. Plant Journal. 35 (3), 305-315 (2003).
- Xie, X., et al. Engineering SARS-CoV-2 using a reverse genetic system. Nature Protocols. 16, (2021).
- Xu, J., et al. Optimized plasmid construction strategy for Cas9. Cellular Physiology and Biochemistry. 48, 131-137 (2018).
- Mattanovich, D., et al. Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (16), 6747 (1989).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
- Tramier, M., et al. Picosecond-hetero-FRET microscopy to probe protein-protein interactions in live cells. Biophysical Journal. 83 (6), 3570-3577 (2002).
- Alvarez, L. A. J., et al. SP8 FALCON: a novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM. Nature Methods. 20, 2-4 (2019).
- Postma, M., Goedhart, J. Plotsofdata-a web app for visualizing data together with their summaries. PLoS Biology. 17 (3), 1-8 (2019).
- Galperin, E., Verkhusha, V. V., Sorkin, A. Three-chromophore fret microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nature Methods. 1 (3), 209-217 (2004).
- Waadt, R., Kudla, J. In plant visualization of protein interactions using bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Cold Spring Harbor Protocols. 3 (4), (2008).
