Bestimmung der dreigliedrigen Wechselwirkung zwischen zwei Monomeren eines MADS-Box-Transkriptionsfaktors und eines Calcium-Sensorproteins mittels BiFC-FRET-FLIM-Assay

Summary

Hier stellen wir eine Methode zur Visualisierung der ternären Komplexbildung zwischen drei Proteinpartnern unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Proteine durch BiFC-basierten FRET-FLIM-Assay vor. Diese Methode ist wertvoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionskomplexen in vivo.

Abstract

Protein-Protein-Interaktionen sind ein integraler Bestandteil aller biologischen Prozesse in den Zellen, da sie eine entscheidende Rolle bei der Regulierung, Aufrechterhaltung und Änderung zellulärer Funktionen spielen. Diese Wechselwirkungen sind an einer Vielzahl von Phänomenen wie Signaltransduktion, Pathogenantwort, Zell-Zell-Interaktionen, Stoffwechsel- und Entwicklungsprozessen beteiligt. Im Falle von Transkriptionsfaktoren können diese Wechselwirkungen zu einer Oligomerisierung von Untereinheiten führen, die in spezifischen subzellulären Kontexten wie Kern, Zytoplasma usw. sequestriert werden, was wiederum einen tiefgreifenderen Einfluss auf die Expression der nachgeschalteten Gene haben könnte. Hier demonstrieren wir eine Methodik zur Visualisierung der dreigliedrigen In-vivo-Interaktion unter Verwendung der bimolekulären Fluoreszenzkomplementierung (BiFC) basierenden Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) mit Fluoreszenz-Lifetime-Imaging (FLIM). Zwei der für diese Demonstration ausgewählten Proteine interagieren als BiFC-Partner, und ihre rekonstituierte Fluoreszenzaktivität wird verwendet, um FRET-FLIM mit dem dritten Partner zu testen. Vier bis fünf Wochen alte, in der Wachstumskammer angebaute Nicotiana benthamiana-Pflanzen wurden als Modellpflanzensystem für diese Demonstration verwendet.

Introduction

Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) bilden die Grundlage für das reibungslose Funktionieren der eukaryotischen Zellen, indem sie verschiedene Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse regulieren. Einige PPIs sind stabil, während andere vorübergehender Natur sind. Die Wechselwirkungen können basierend auf der Anzahl und Art der Mitglieder in der Wechselwirkung kategorisiert werden, z. B. dimer, trimer, tetramer homomer und heteromer¹. Die Identifizierung und Charakterisierung von Proteininteraktionen kann zu einem besseren Verständnis von Proteinfunktionen und regulatorischen Netzwerken führen.

Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an regulatorischen Funktionen beteiligt sind. Sie regulieren die Transkriptionsrate ihrer nachgeschalteten Gene, indem sie an die DNA binden. Manchmal ist die Oligomerisierung oder Bildung von Komplexen höherer Ordnung durch Proteine eine Voraussetzung für die Ausübung ihrer Funktionen². Pflanzliche MADS-Box-Transkriptionsfaktoren sind homöotische Gene, die verschiedene Prozesse wie Blütenübergang, Blütenorganentwicklung, Befruchtung, Samenentwicklung, Seneszenz und vegetative Entwicklung regulieren. Es ist bekannt, dass sie Komplexe höherer Ordnung bilden, die an die DNA^{binden 3,4}. Die Untersuchung von PPI-Netzwerken zwischen Transkriptionsfaktoren und ihren Interaktoren liefert Einblicke in die Komplexität, die der transkriptionellen Regulation zugrunde liegt.

Die transiente Proteinexpression in Nicotiana benthamiana war ein beliebter Ansatz, um proteinlokalisation oder Protein-Protein-Interaktionen in vivozu^{untersuchen 5}. BiFC und FRET sind Methoden zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in vivo unter Verwendung fluoreszierender Reportersysteme⁶. Es wurde gezeigt, dass eine Kombination dieser beiden Techniken die Wechselwirkung zwischen drei Proteinen aufdeckt⁷. FRET wird mit Akzeptor-Photobleiching, sensibilisierter Emission und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging (FLIM) -Technik gemessen. Der FLIM-basierte FRET-Assay hat sich zu einem Werkzeug entwickelt, das eine genaue Quantifizierung und raumzeitliche Spezifität für Energietransfermessungen zwischen zwei Molekülen basierend auf ihrer Fluoreszenzlebensdauer ermöglicht⁸. FLIM misst die Zeit, in der ein Fluorophor in einem angeregten Zustand bleibt, bevor es ein Photon emittiert, und ist besser als Techniken, die nur Intensitätsmessungen verwenden^9,10. Neben heterologen Systemen wie Nicotiana benthamiana und Zwiebel-Epidermisschalen haben neuere Berichte die Verwendung von Arabidopsis-Wurzeln und jungen Reissämlingen usw. für die In-vivo-Analyse von Protein-Protein-Interaktionen unter nativen Bedingungen gezeigt^11,12.

Neben einem geeigneten Expressionssystem ist auch die Auswahl der interagierenden Partner für BiFC- und FRET-Assays entscheidend für den Erfolg dieses Experiments. Der PPI zwischen Partnern, die in der BiFC-Konfiguration verwendet werden, sollte vor ihrer Verwendung als konjugierter Partner im FRET-Experiment¹³mit geeigneten Kontrollen validiert werden. BiFC nutzt die strukturelle Komplementierung von N- und C-terminalen Teilen des fluoreszierenden Proteins. Eine häufige Einschränkung in den meisten, wenn nicht allen fluoreszierenden Proteinen, die in BiFC-Assays verwendet werden, war die Selbstorganisation zwischen den beiden abgeleiteten nichtfluoreszierenden Fragmenten, die zu einer falsch positiven Fluoreszenz beitrug und das Signal-Rausch-Verhältnis (S / N)¹⁴verringerte. Jüngste Entwicklungen, einschließlich Punktmutationen oder der Position der Spaltung des fluoreszierenden Proteins, haben zu BiFC-Paaren mit erhöhter Intensität, höherer Spezifität, hohem S /N-Verhältnis^15,16geführt. Diese fluoreszierenden Proteine können je nach Eignung des Experiments auch zur Durchführung von BiFC verwendet werden.

Traditionell wurden CFP und YFP als Donor- und Akzeptorpaar in FRET-Experimenten^{verwendet 17}. Es wurde jedoch festgestellt, dass YFP oder m-Citrin aufgrund der hohen Quantenausbeute (QY) während der nativen Expression von Zielproteinen im Arabidopsis-Wurzelsystem bessere FRET-Donatoren sind (wenn sie mit RFP als Akzeptor verwendet werden). Die Auswahl von Promotoren (konstitutiv versus native/endogen) und Fluorophoren spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung eines erfolgreichen BiFC-FRET-FLIM-Experiments. Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Effizienz von FRET-Donatoren und die Eignung von FRET-Paaren tendenziell mit der Änderung des Promotors und des biologischen Systems, das für die Expression verwendet wird, ändern. Die QY des Fluorophors, die sich auf seine Helligkeit bezieht, hängt vom pH-Wert, der Temperatur und dem verwendeten biologischen System ab. Wir schlagen vor, dass diese Kriterien gründlich berücksichtigt werden, bevor das Fluorophorpaar für das FRET-Experiment ausgewählt wird. Das biologische System, die Promotoren und die Proteine, die für dieses Protokoll verwendet wurden, funktionierten gut mit CFP-YFP-Fluorophoren für das BiFC FRET-FLIM-Experiment.

In der vorliegenden Studie integrieren wir die Funktion von FLIM, um die Wechselwirkung zwischen drei Proteinmolekülen mit BiFC-basierter FRET zu visualisieren. Bei dieser Technik werden zwei Proteine mit gespaltenem YFP-Protein und das dritte Protein mit CFP markiert. Da wir daran interessiert waren, die Interaktion eines MADS-Box-Protein (M) Homodimers mit einem Calcium-Sensorprotein (C) zu untersuchen, wurden diese Proteine mit fluoreszierenden Proteinen in pSITE-1CA- und pSITE-3CA-Vektoren^{markiert 18}. Zwei der interagierenden Partner wurden in diesem Assay mit N- und C-terminalen Teilen des YFP in pSPYNE-35S- und pSPYCE-35S-Vektoren¹⁹markiert, und ihre Interaktion führt zur Rekonstitution des funktionellen YFP, das als FRET-Akzeptor fungiert, zum dritten interagierenden Partner, der mit CFP (als FRET-Donor fungierend) markiert ist(Abbildung 1 ). In diesem speziellen Fall wurde der PPI zwischen zwei M-Monomeren und zwischen M und C validiert, indem BiFC in drei verschiedenen Systemen zusammen mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System durchgeführt wurde. Diese Vektoren wurden durch Elektroporation in den Stamm Agrobacterium tumifaciens GV3101 mobilisiert. Der Stamm GV3101 hat ein entwaffnetes Ti-Plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) mit Gentamicin-Resistenz²⁰. Ein p19 Agrobacterium-Stamm wurde zusammen mit allen Infiltrationen hinzugefügt, um eine Transgen-Stummschaltung zu verhindern²¹. Wir empfehlen, dass die drei Proteine auch in entgegengesetzten Konformationen verwendet werden sollten, um die dreigliedrigen Wechselwirkungen zu validieren.

Bei dieser Technik haben wir FLIM eingesetzt, wobei zunächst die Fluoreszenzlebensdauer des Spenders (ungequetschte Spenderlebensdauer) in Abwesenheit eines Akzeptors gemessen wird. Danach wird seine Lebensdauer in Gegenwart des Akzeptors gemessen (abgeschreckte Spenderlebensdauer). Dieser Unterschied in der Donorfluoreszenzlebensdauer wird verwendet, um die FRET-Effizienz zu berechnen, die von der Anzahl der Photonen abhängt, die eine Verringerung der Fluoreszenzlebensdauer aufweisen. Im Folgenden finden Sie ein detailliertes Protokoll zur Bestimmung der Bildung eines ternären Komplexes zwischen drei beliebigen Proteinen, indem die fluoreszierenden markierten Proteine in Nicotiana benthamiana vorübergehend exprimiert und ihre Interaktion durch BiFC-FRET-FLIM untersucht werden.

Protocol

1. Klonen von Genen in Eintrags- und Zielvektoren (Abbildung 2) Amplifizieren Sie die kodierende Sequenz (CDS) der interessierenden Gene (in unserem Fall M- und C-Gene) durch PCR und klonieren Sie sie in geeigneten Eingangsvektoren (z. B. pENTR/D-TOPO-Vektor; siehe Tabelle 1 für die in diesem Experiment verwendeten Vektoren). Züchten Sie die Klone auf Platten, die Antibiotika enthalten. Validierung von Klonen, …

Representative Results

Dieses Protokoll stellt eine optimierte Methode zur Untersuchung von in vivo dreigliedrigen Protein-Protein-Interaktionen in Pflanzen dar. Das Grundprinzip des Protokolls besteht darin, zwei fluoreszenzmarkierte Protein-Interaktionstechniken, d.h. BiFC und FRET, zu kombinieren, um einen Assay zur Messung der ternären Komplexbildung zwischen drei Proteinpartnern zu erstellen. Hier haben wir FLIM verwendet, um die Fluoreszenzlebensdauer des FRET-Donorpartners in Gegenwart und Abwesenheit des FRET-Akzeptors zu mes…

Discussion

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines BiFC-basierten FRET-FLIM-Assays zur Bestimmung der Bildung eines ternären Komplexes zwischen zwei Monomeren eines MADS-Box-Proteins und eines Calciumsensorproteins. Das Protokoll basiert auf einem Bericht von Y. John Shyu et al., wo sie eine BiFC-basierte FRET-Methode entwickelt haben, um ternäre Komplexe zu visualisieren, die zwischen Fos-Jun-Heterodimeren und NFAT oder p65 unter Verwendung der sensibilisierten Emissionsmethode gebildet werden<sup class="xref…

Materials

1 ml Syringes without needles	Dispovan	-
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mix	Thermo Fischer Scientific	11791020	The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin Sulphate	Himedia	CMS461
Kanamycin Sulphate	Himedia	MB105
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Thermo Fischer Scientific	K240020	The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase	Thermo Fischer Scientific	F530-S	Any High fidelity Polymerase can work
Rifampicin	Himedia	CMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope	Leica	SP8 FALCON	Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	Himedia	TC034