पूरे माउस हार्ट की मेसोस्कोपिक ऑप्टिकल इमेजिंग
Summary
हम एक अक्षीय रूप से स्कैन किए गए प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के विकास के साथ ऊतक परिवर्तन और धुंधलापन में नई प्रगति के संयोजन से पूरे माउस हृदय के मेसोस्कोपिक पुनर्निर्माण के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं।
Abstract
आनुवंशिक और गैर-आनुवंशिक हृदय रोग दोनों हृदय में गंभीर रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं का कारण बन सकते हैं। संरचनात्मक रीमॉडेलिंग, जैसे कोलेजन जमाव (फाइब्रोसिस) और सेलुलर मिसलिग्नमेंट, विद्युत चालन को प्रभावित कर सकते हैं, इलेक्ट्रोमैकेनिकल डिसफंक्शन पेश कर सकते हैं और अंततः, अतालता का कारण बन सकते हैं। इन कार्यात्मक परिवर्तनों के वर्तमान पूर्वानुमान मॉडल गैर-एकीकृत और कम-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक जानकारी पर आधारित हैं। बड़े पैमाने पर ऊतक में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने में मानक इमेजिंग विधियों की अक्षमता के कारण इस ढांचे को परिमाण के एक अलग क्रम पर रखना चुनौतीपूर्ण है। इस काम में, हम एक पद्धतिगत ढांचे का वर्णन करते हैं जो माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे माउस दिल की इमेजिंग की अनुमति देता है। इस लक्ष्य की उपलब्धि के लिए एक तकनीकी प्रयास की आवश्यकता है जहां ऊतक परिवर्तन और इमेजिंग विधियों में प्रगति को जोड़ा गया है। सबसे पहले, हम एक अनुकूलित स्पष्टता प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एक बरकरार दिल को एक नैनोपोरस, हाइड्रोगेल-हाइब्रिडाइज्ड, लिपिड-मुक्त रूप में बदलने में सक्षम है जो उच्च पारदर्शिता और गहरे धुंधलापन की अनुमति देता है। फिर, एक फ्लोरेसेंस लाइट-शीट माइक्रोस्कोप माइक्रोन-स्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ एक मेसोस्कोपिक फील्ड ऑफ व्यू (एमएम-स्केल) की छवियों को तेजी से प्राप्त करने में सक्षम है। मेसोएसपीआईएम परियोजना के बाद, कल्पना की गई माइक्रोस्कोप एक एकल टोमोग्राफिक स्कैन में माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे माउस हृदय के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। हमारा मानना है कि यह पद्धतिगत ढांचा विद्युत शिथिलता में साइटोआर्किटेक्चर अव्यवस्था की भागीदारी को स्पष्ट करने की अनुमति देगा और एक व्यापक मॉडल के लिए मार्ग प्रशस्त करेगा जो कार्यात्मक और संरचनात्मक डेटा दोनों पर विचार करता है, इस प्रकार संरचनात्मक कारणों की एकीकृत जांच को सक्षम करेगा जो ऊतक रीमॉडेलिंग के बाद विद्युत और यांत्रिक परिवर्तन ों का कारण बनता है।
Introduction
हृदय रोगों से जुड़े संरचनात्मक रीमॉडेलिंग विद्युत चालन को प्रभावित कर सकते हैं और अंग 1,2 के इलेक्ट्रोमैकेनिकल डिसफंक्शन पेश कर सकते हैं। कार्यात्मक परिवर्तनों की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान दृष्टिकोण आमतौर पर फाइब्रोसिस जमाव, संवहनी पेड़ और हृदय के फाइबर वितरण के समग्र पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के लिए एमआरआई और डीटी-एमआरआई का उपयोग करते हैं, और उनका उपयोग अंग 3,4 में अधिमान्य कार्रवाई संभावित प्रसार (एपीपी) पथों को मॉडल करने के लिए किया जाता है। ये रणनीतियाँ हृदय संगठन का एक सुंदर अवलोकन प्रदान कर सकती हैं। हालांकि, सेलुलर स्तर पर कार्डियक फ़ंक्शन पर संरचनात्मक रीमॉडेलिंग के प्रभाव की जांच करने के लिए उनका स्थानिक संकल्प अपर्याप्त है।
इस ढांचे को परिमाण के एक अलग क्रम पर रखना, जहां एकल कोशिकाएं कार्रवाई संभावित प्रसार पर व्यक्तिगत भूमिका निभा सकती हैं, चुनौतीपूर्ण है। मुख्य सीमा बड़े पैमाने पर (सेंटीमीटर आकार के) ऊतकों में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग (माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन) करने के लिए मानक इमेजिंग विधियों की अक्षमता है। वास्तव में, ऊतक अपारदर्शिता के कारण उच्च रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी में इमेजिंग जैविक ऊतक बहुत जटिल है। पूरे अंगों में 3 डी पुनर्निर्माण करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण पतले वर्गों को तैयार करना है। हालांकि, सटीक सेक्शनिंग, असेंबलिंग और इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण प्रयास और समय की आवश्यकता होती है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो नमूने को काटने की मांग नहीं करता है, वह एक पारदर्शी ऊतक उत्पन्न करना है। पिछले वर्षों के दौरान, ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए कई पद्धतियों का प्रस्ताव किया गया है 5,6,7,8। बड़े पैमाने पर, पारदर्शी और फ्लोरोसेंटली-लेबल ऊतकों का उत्पादन करने की चुनौती हाल ही में सच्चे ऊतक परिवर्तन दृष्टिकोण (क्लैरिटी9, शील्ड10) विकसित करके हासिल की गई है। विशेष रूप से, स्पष्टता विधि एक बरकरार ऊतक के एक नैनोपोरस, हाइड्रोगेल-हाइब्रिडाइज्ड, लिपिड-मुक्त रूप में परिवर्तन पर आधारित है जो झिल्ली लिपिड बाइलेयर के चयनात्मक हटाने से उच्च पारदर्शिता प्रदान करने में सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, यह विधि कार्डियक तैयारी 11,12,13,14 में भी सफल पाई गई है। हालांकि, चूंकि दिल एक सक्रिय समाशोधन के लिए उपयुक्त होने के लिए बहुत नाजुक है, इसलिए इसे निष्क्रिय दृष्टिकोण का उपयोग करके साफ किया जाना चाहिए, जिसे पूर्ण पारदर्शिता प्रदान करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है।
लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी जैसी उन्नत इमेजिंग तकनीकों के संयोजन में, क्लैरिटी में माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन पर 3 डी बड़े पैमाने पर हृदय के ऊतकों को चित्रित करने की क्षमता है। प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी में, नमूने की रोशनी का पता लगाने के उद्देश्य के फोकल प्लेन में सीमित प्रकाश की एक पतली शीट के साथ प्रदर्शन किया जाता है। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को रोशनी विमान15 के लंबवत एक अक्ष के साथ एकत्र किया जाता है। डिटेक्शन आर्किटेक्चर वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के समान है, जिससे अधिग्रहण लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप की तुलना में बहुत तेज हो जाता है। प्रकाश शीट के माध्यम से नमूने को स्थानांतरित करने से सेंटीमीटर आकार के नमूनों तक बड़े नमूनों की एक पूरी टोमोग्राफी प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। हालांकि, गॉसियन बीम के आंतरिक गुणों के कारण, सीमित स्थानिक विस्तार के लिए केवल एक बहुत पतली (कुछ माइक्रोन के क्रम में) प्रकाश-शीट प्राप्त करना संभव है, इस प्रकार दृश्य के क्षेत्र (एफओवी) को काफी सीमित कर दिया गया है। हाल ही में, इस सीमा को दूर करने के लिए एक नई उत्तेजना योजना पेश की गई है और मस्तिष्क इमेजिंग के लिए लागू की गई है, जिससे आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन16 के साथ 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति मिलती है।
इस पेपर में, एक निष्क्रिय समाशोधन दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है, जो स्पष्टता प्रोटोकॉल द्वारा आवश्यक समाशोधन समय में महत्वपूर्ण कमी को सक्षम करता है। यहां वर्णित पद्धतिगत ढांचा मिनटों के क्रम में अधिग्रहण समय के साथ एकल टोमोग्राफिक स्कैन में माइक्रोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एक पूरे माउस दिल का पुनर्निर्माण करने की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, उच्च रिज़ॉल्यूशन पर एक पूरे माउस दिल को साफ करने, दागने और छवि बनाने के लिए एक सफल दृष्टिकोण पेश किया गया था। सबसे पहले, एक ऊतक परिवर्तन प्रोटोकॉल (स्पष्टता) को अनुकूलित और प्रदर्शन किया गया थ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से अनुदान समझौते नो 952166 (मरम्मत), एफआईएसआर कार्यक्रम के तहत एमयूआर, परियोजना FISR2019_00320 और रीजन टोस्काना, बैंडो राइसर्का सैल्यूट 2018, परकेयर परियोजना से धन प्राप्त हुआ है।
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
