Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato
Summary
Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.
Abstract
Doenças cardíacas genéticas e não genéticas podem causar processos graves de remodelação no coração. O remodelamento estrutural, como a deposição de colágeno (fibrose) e o desalinhamento celular, pode afetar a condução elétrica, introduzir disfunções eletromecânicas e, eventualmente, levar à arritmia. Os modelos preditivos atuais dessas alterações funcionais são baseados em informações estruturais não integradas e de baixa resolução. Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude é um desafio devido à ineficácia dos métodos de imagem padrão na realização de imagens de alta resolução em tecidos maciços. Neste trabalho, descrevemos um referencial metodológico que permite a imagem de corações inteiros de camundongos com resolução micrométrica. A consecução deste objetivo exigiu um esforço tecnológico onde os avanços na transformação de tecidos e métodos de imagem foram combinados. Primeiro, descrevemos um protocolo CLARITY otimizado capaz de transformar um coração intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite alta transparência e coloração profunda. Em seguida, um microscópio de folha de luz de fluorescência capaz de adquirir rapidamente imagens de um campo de visão mesoscópico (escala mm) com a resolução em escala mícron é descrito. Seguindo o projeto mesoSPIM, o microscópio concebido permite a reconstrução de todo o coração do rato com resolução micrométrica em uma única varredura tomográfica. Acreditamos que esse referencial metodológico permitirá esclarecer o envolvimento do desarranjo citoarquitetônico nas disfunções elétricas e abrir caminho para um modelo abrangente que considere tanto os dados funcionais quanto estruturais, possibilitando assim uma investigação unificada das causas estruturais que levam a alterações elétricas e mecânicas após o remodelamento tecidual.
Introduction
O remodelamento estrutural associado a doenças cardíacas pode afetar a condução elétrica e introduzir disfunções eletromecânicas do órgão 1,2. As abordagens atuais utilizadas para predizer alterações funcionais comumente empregam RM e DT-MRI para obter uma reconstrução geral da deposição de fibrose, árvore vascular e distribuição de fibras do coração, e são usadas para modelar caminhos de propagação do potencial de ação preferencial (APP) através do órgão 3,4. Essas estratégias podem fornecer uma bela visão geral da organização do coração. No entanto, sua resolução espacial é insuficiente para investigar o impacto do remodelamento estrutural na função cardíaca em nível celular.
Colocar essa estrutura em uma ordem diferente de magnitude, onde células individuais podem desempenhar papéis individuais na propagação do potencial de ação, é um desafio. A principal limitação é a ineficiência dos métodos de imagem padrão para realizar imagens de alta resolução (resolução micrométrica) em tecidos maciços (tamanho de centímetros). De fato, a imagem de tecidos biológicos em 3D em alta resolução é muito complicada devido à opacidade do tecido. A abordagem mais comum para realizar reconstruções 3D em órgãos inteiros é preparar seções finas. No entanto, o seccionamento, a montagem e a imagem precisos exigem esforço e tempo significativos. Uma abordagem alternativa que não exija o corte da amostra é gerar um tecido transparente. Nos últimos anos, diversas metodologias de clarificação de tecidos têm sido propostas 5,6,7,8. O desafio de produzir tecidos maciços, transparentes e marcados fluorescentemente foi recentemente alcançado através do desenvolvimento de verdadeiras abordagens de transformação de tecidos (CLARITY9, SHIELD10). Em particular, o método CLARITY baseia-se na transformação de um tecido intacto em uma forma nanoporosa, hibridizada em hidrogel e livre de lipídios que permite conferir alta transparência pela remoção seletiva de bicamadas lipídicas de membrana. Notavelmente, esse método tem sido bem sucedido também no preparo cardíaco 11,12,13,14. No entanto, uma vez que o coração é demasiado frágil para ser adequado para uma clareira activa, deve ser limpo utilizando a abordagem passiva, que requer muito tempo para conferir total transparência.
Em combinação com técnicas avançadas de imagem, como a microscopia de folha de luz, o CLARITY tem o potencial de visualizar tecidos cardíacos maciços em 3D em resolução micrométrica. Na microscopia de folha de luz, a iluminação da amostra é realizada com uma fina folha de luz confinada no plano focal do objetivo de detecção. A emissão de fluorescência é coletada ao longo de um eixo perpendicular ao plano de iluminação15. A arquitetura de detecção é semelhante à microscopia de campo amplo, tornando a aquisição muito mais rápida do que os microscópios de varredura a laser. Mover a amostra através da folha de luz permite obter uma tomografia completa de grandes espécimes, amostras de até centímetros. No entanto, devido às propriedades intrínsecas do feixe gaussiano, é possível obter uma folha de luz muito fina (da ordem de alguns mícrons) apenas para uma extensão espacial limitada, limitando drasticamente o campo de visão (FoV). Recentemente, um novo esquema de excitação foi introduzido para superar essa limitação e aplicado para imagens cerebrais, permitindo reconstruções 3D com resolução isotrópica16.
Neste artigo, uma abordagem de compensação passiva é apresentada, permitindo uma redução significativa do tempo de compensação necessário para o protocolo CLARITY. O referencial metodológico aqui descrito permite reconstruir todo um coração de camundongo com resolução micrométrica em uma única tomografia com tempo de aquisição na ordem de minutos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, uma abordagem bem-sucedida para limpar, manchar e visualizar todo o coração de um rato em alta resolução foi introduzida. Primeiramente, um protocolo de transformação tecidual (CLARITY) foi otimizado e realizado, levemente modificado para sua aplicação no tecido cardíaco. De fato, para obter uma reconstrução eficiente em 3D de todo um coração, é essencial evitar o fenômeno da dispersão da luz. A metodologia CLARITY permite-nos obter um coração intacto altamente transparente, mas requer l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto recebeu financiamentos do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do contrato de subvenção n.º 952166 (REPAIR), MUR no âmbito do programa FISR, projeto FISR2019_00320 e Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projeto PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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