全小鼠心脏的介观光学成像
Summary
我们报告了一种将组织转化和染色的新进展与轴向扫描光片显微镜的开发相结合的整个小鼠心脏的介观重建方法。
Abstract
遗传性和非遗传性心脏病都可能导致心脏发生严重的重塑过程。结构重塑，如胶原沉积（纤维化）和细胞错位，会影响电传导，引入机电功能障碍，最终导致心律失常。目前这些功能改变的预测模型基于非整合和低分辨率的结构信息。由于标准成像方法在大块组织中执行高分辨率成像时效率低下，因此将该框架置于不同的数量级上具有挑战性。在这项工作中，我们描述了一种方法框架，该方法框架允许以微米分辨率对整个小鼠心脏进行成像。实现这一目标需要技术努力，将组织转化和成像方法的进步结合起来。首先，我们描述了一种优化的CLARITY方案，能够将完整的心脏转化为纳米多孔，水凝胶杂交，无脂质形式，从而实现高透明度和深度染色。然后，描述了一种能够以微米级分辨率快速获取介观视场（mm尺度）图像的荧光光片显微镜。在mesoSPIM项目之后，构思的显微镜允许在单次断层扫描中以微米分辨率重建整个小鼠心脏。我们相信，这种方法框架将允许澄清细胞结构紊乱在电功能障碍中的参与，并为考虑功能和结构数据的综合模型铺平道路，从而能够统一研究导致组织重塑后电气和机械改变的结构原因。
Introduction
与心脏病相关的结构重塑会影响电传导并引入器官的机电功能障碍1，2。目前用于预测功能改变的方法通常采用MRI和DT-MRI来获得纤维化沉积，血管树和心脏纤维分布的整体重建，并且它们用于模拟跨器官的优先动作电位传播（APP）路径3，4。这些策略可以提供心脏组织的美丽概述。然而，它们的空间分辨率不足以在细胞水平上研究结构重塑对心脏功能的影响。
将这个框架放在不同的数量级，其中单个细胞可以在动作电位传播中发挥个体作用，这是具有挑战性的。主要限制是在大块（厘米大小）组织中执行高分辨率成像（微米分辨率）的标准成像方法效率低下。事实上，由于组织不透明，以高分辨率对生物组织进行3D成像非常复杂。在整个器官中进行3D重建的最常见方法是准备薄切片。然而，精确的切片、组装和成像需要大量的精力和时间。一种不需要切割样品的替代方法是生成透明组织。在过去几年中，已经提出了几种澄清组织的方法5，6，7，8。最近通过开发真正的组织转化方法（CLARITY9，SHIELD10）实现了生产大块，透明和荧光标记组织的挑战。特别是，CLARITY方法基于将完整组织转化为纳米多孔，水凝胶杂交，无脂形式，能够通过选择性去除膜脂质双层来赋予高透明度。值得注意的是，该方法在心脏制备中也被发现成功11，12，13，14。然而，由于心脏太脆弱而不适合主动清除，因此必须使用被动方法清除它，这需要很长时间才能赋予完全透明。
结合光片显微镜等先进的成像技术，CLARITY有可能以微米分辨率对3D大块心脏组织进行成像。在光片显微镜中，样品的照明是用限制在检测物镜焦平面上的薄片光进行的。荧光发射沿垂直于照明平面15的轴收集。该检测架构类似于宽场显微镜，使采集速度比激光扫描显微镜快得多。将样品穿过光片可以获得大样本的完整断层扫描，最大可达厘米大小的样品。然而，由于高斯光束的内在特性，只有在有限的空间扩展下，才有可能获得非常薄（几微米量级）的光片，从而极大地限制了视场（FoV）。最近，已经引入了一种新的激发方案来克服这一限制并应用于脑成像，允许以各向同性分辨率16进行3D重建。
在本文中，提出了一种被动清除方法，可以显着减少CLARITY协议所需的清除时间。这里描述的方法框架允许在单次断层扫描中以微米分辨率重建整个小鼠心脏，采集时间为几分钟。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项工作中，介绍了一种以高分辨率清除、染色和成像整个小鼠心脏的成功方法。首先，优化并执行组织转化方案（CLARITY），并针对其在心脏组织中的应用进行了轻微修改。事实上，为了获得整个心脏的3D有效重建，必须防止光散射现象。CLARITY方法使我们能够获得高度透明的完整心脏，但是被动进行时需要较长的潜伏时间（约5个月）。关于大脑，心脏组织不适合利用电场的主动清除。即使在?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目已获得欧盟地平线2020研究和创新计划的资金，根据赠款协议No 952166（REPAIR），FISR计划下的MUR，项目FISR2019_00320和托斯卡纳地区，Bando Ricerca Salute 2018，PERCARE项目。
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
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