Mesoskopisk optisk billeddannelse af hele musehjertet
Summary
Vi rapporterer en metode til mesoskopisk rekonstruktion af hele musehjertet ved at kombinere nye fremskridt inden for vævstransformation og farvning med udviklingen af et aksialt scannet lysarkmikroskop.
Abstract
Både genetiske og ikke-genetiske hjertesygdomme kan forårsage alvorlige ombygningsprocesser i hjertet. Strukturel ombygning, såsom kollagenaflejring (fibrose) og cellulær forskydning, kan påvirke elektrisk ledning, introducere elektromekaniske dysfunktioner og i sidste ende føre til arytmi. Nuværende prædiktive modeller af disse funktionelle ændringer er baseret på ikke-integrerede strukturelle oplysninger med lav opløsning. At placere denne ramme i en anden størrelsesorden er udfordrende på grund af ineffektiviteten af standardbilleddannelsesmetoder til udførelse af billeddannelse i høj opløsning i massivt væv. I dette arbejde beskriver vi en metodologisk ramme, der tillader billeddannelse af hele musehjerter med mikrometrisk opløsning. Opnåelsen af dette mål har krævet en teknologisk indsats, hvor fremskridt inden for vævstransformation og billeddannelsesmetoder er blevet kombineret. For det første beskriver vi en optimeret CLARITY-protokol, der er i stand til at omdanne et intakt hjerte til en nanoporøs, hydrogelhybridiseret, lipidfri form, der tillader høj gennemsigtighed og dyb farvning. Derefter beskrives et fluorescenslysarkmikroskop, der hurtigt kan erhverve billeder af et mesoskopisk synsfelt (mm-skala) med mikronskalaopløsningen. Efter mesoSPIM-projektet tillader det udtænkte mikroskop rekonstruktion af hele musehjertet med mikrometrisk opløsning i en enkelt tomografisk scanning. Vi mener, at denne metodologiske ramme vil gøre det muligt at afklare inddragelsen af cytoarkitekturens uorden i de elektriske dysfunktioner og bane vejen for en omfattende model, der overvejer både de funktionelle og strukturelle data, hvilket muliggør en samlet undersøgelse af de strukturelle årsager, der fører til elektriske og mekaniske ændringer efter vævsombygningen.
Introduction
Strukturel ombygning forbundet med hjertesygdomme kan påvirke elektrisk ledning og indføre elektromekaniske dysfunktioner i organet 1,2. Nuværende tilgange, der bruges til at forudsige funktionelle ændringer, anvender almindeligvis MR og DT-MR for at opnå en samlet rekonstruktion af fibroseaflejring, vaskulær træ- og fiberfordeling af hjertet, og de bruges til at modellere præferenceaktionspotentialeudbredelse (APP) stier over organet 3,4. Disse strategier kan give et smukt overblik over hjerteorganisationen. Imidlertid er deres rumlige opløsning utilstrækkelig til at undersøge virkningen af strukturel ombygning på hjertefunktion på celleniveau.
Det er udfordrende at placere denne ramme i en anden størrelsesorden, hvor enkeltceller kan spille individuelle roller på handlingspotentialeudbredelse. Den største begrænsning er ineffektiviteten af standardbilleddannelsesmetoder til at udføre billeddannelse i høj opløsning (mikrometrisk opløsning) i massive (centimeterstore) væv. Faktisk er billeddannelse af biologiske væv i 3D ved høj opløsning meget kompliceret på grund af vævets uigennemsigtighed. Den mest almindelige tilgang til at udføre 3D-rekonstruktioner i hele organer er at forberede tynde sektioner. Præcis sektionering, samling og billeddannelse kræver dog en betydelig indsats og tid. En alternativ tilgang, der ikke kræver udskæring af prøven, er at generere et gennemsigtigt væv. I løbet af de sidste år er der foreslået flere metoder til afklaring af væv 5,6,7,8. Udfordringen med at producere massivt, gennemsigtigt og fluorescerende mærket væv er for nylig opnået ved at udvikle ægte vævstransformationsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). Clarity-metoden er især baseret på omdannelse af et intakt væv til en nanoporøs, hydrogelhybridiseret, lipidfri form, der gør det muligt at give høj gennemsigtighed ved selektiv fjernelse af membranlipiddobbeltlag. Især har denne metode vist sig at være vellykket også i hjertepræparat11,12,13,14. Men da hjertet er for skrøbeligt til at være egnet til en aktiv rydning, skal det ryddes ved hjælp af den passive tilgang, som kræver lang tid at give fuldstændig gennemsigtighed.
I kombination med avancerede billeddannelsesteknikker som lysarkmikroskopi har CLARITY potentialet til at afbilde 3D massivt hjertevæv ved mikrometrisk opløsning. I lysarkmikroskopi udføres belysningen af prøven med et tyndt lysark, der er begrænset i detektionsmålets fokusplan. Fluorescensemissionen opsamles langs en akse vinkelret på belysningsplanet15. Detektionsarkitekturen ligner widefield-mikroskopi, hvilket gør erhvervelsen meget hurtigere end laserscanningsmikroskoper. Flytning af prøven gennem lysarket gør det muligt at opnå en komplet tomografi af store prøver, op til centimeterstore prøver. På grund af den gaussiske stråles iboende egenskaber er det imidlertid kun muligt at opnå et meget tyndt (i størrelsesordenen nogle få mikron) lysark til en begrænset rumlig udvidelse, hvilket drastisk begrænser synsfeltet (FoV). For nylig er en ny excitationsordning blevet introduceret for at overvinde denne begrænsning og anvendt til hjernebilleddannelse, hvilket tillader 3d-rekonstruktioner med isotrop opløsning16.
I dette dokument præsenteres en passiv clearingmetode, der muliggør en betydelig reduktion af den clearingtid, der er nødvendig i henhold til CLARITY-protokollen. Den metodologiske ramme, der er beskrevet her, gør det muligt at rekonstruere et helt musehjerte med mikrometrisk opløsning i en enkelt tomografisk scanning med en anskaffelsestid i rækkefølgen af minutter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde blev der introduceret en vellykket tilgang til at rydde, plette og afbilde et helt musehjerte i høj opløsning. For det første blev en vævstransformationsprotokol (CLARITY) optimeret og udført, lidt modificeret til dens anvendelse på hjertevævet. For at opnå en effektiv rekonstruktion i 3D af et helt hjerte er det faktisk vigtigt at forhindre fænomenet lysspredning. CLARITY-metoden giver os mulighed for at opnå et meget gennemsigtigt intakt hjerte, men det kræver lange inkubationstider, når det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt har modtaget finansiering fra EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, projekt FISR2019_00320 og Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-projektet.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
