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Bioengineering

स्वचालित माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास माइक्रोबियल Microdroplet संस्कृति प्रणाली (MMC) का उपयोग कर

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/62800
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4, 1,2,6, 1,2,5, 3, 1,2,5
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि स्वचालित माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास का संचालन करने के लिए माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) का उपयोग कैसे करें। एमएमसी स्वचालित रूप से और लगातार सूक्ष्मजीवों की खेती और उप-खेती कर सकता है और अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट और अच्छे समानांतरीकरण के साथ उनके विकास की ऑनलाइन निगरानी कर सकता है, जिससे श्रम और अभिकर्मक खपत कम हो जाती है।

Abstract

पारंपरिक माइक्रोबियल खेती विधियों में आमतौर पर बोझिल संचालन, कम थ्रूपुट, कम दक्षता और श्रम और अभिकर्मकों की बड़ी खपत होती है। इसके अलावा, हाल के वर्षों में विकसित माइक्रोप्लेट-आधारित उच्च-थ्रूपुट खेती के तरीकों में खराब माइक्रोबियल विकास की स्थिति है और उनके कम भंग ऑक्सीजन, खराब मिश्रण और गंभीर वाष्पीकरण और थर्मल प्रभाव के कारण समानांतरीकरण का प्रयोग किया गया है। सूक्ष्म-बूंदों के कई फायदों के कारण, जैसे कि छोटी मात्रा, उच्च थ्रूपुट और मजबूत नियंत्रण क्षमता, बूंद-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक इन समस्याओं को दूर कर सकती है, जिसका उपयोग कई प्रकार के अनुसंधान में किया गया है उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबियल खेती, स्क्रीनिंग और विकास। हालांकि, अधिकांश पूर्व अध्ययन प्रयोगशाला निर्माण और आवेदन के चरण में रहते हैं। कुछ प्रमुख मुद्दे, जैसे कि उच्च परिचालन आवश्यकताएं, उच्च निर्माण कठिनाई, और स्वचालित एकीकरण प्रौद्योगिकी की कमी, माइक्रोबियल अनुसंधान में ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के व्यापक अनुप्रयोग को प्रतिबंधित करती हैं। यहां, एक स्वचालित माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) को ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के आधार पर सफलतापूर्वक विकसित किया गया था, जो माइक्रोबियल ड्रॉपलेट खेती की प्रक्रिया द्वारा आवश्यक टीकाकरण, खेती, ऑनलाइन निगरानी, उप-खेती, छंटाई और नमूनाकरण जैसे कार्यों के एकीकरण को प्राप्त करता है। इस प्रोटोकॉल में, जंगली-प्रकार के Escherichia coli (ई कोलाई) MG1655 और एक मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई तनाव (MeSV2.2) को स्वचालित और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास का संचालन करने के लिए एमएमसी का उपयोग करने के तरीके को पेश करने के लिए उदाहरण के रूप में लिया गया था। इस विधि को संचालित करना आसान है, कम श्रम और अभिकर्मकों का उपभोग करता है, और इसमें उच्च प्रयोगात्मक थ्रूपुट और अच्छा डेटा समानता है, जिसमें पारंपरिक खेती के तरीकों की तुलना में बहुत फायदे हैं। यह वैज्ञानिक शोधकर्ताओं के लिए संबंधित माइक्रोबियल अनुसंधान करने के लिए एक कम लागत, संचालन के अनुकूल और परिणाम-विश्वसनीय प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है।

Introduction

माइक्रोबियल खेती सूक्ष्मजीवविज्ञानी वैज्ञानिक अनुसंधान और औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण आधार है, जिसका व्यापक रूप से सूक्ष्मजीवों के अलगाव, पहचान, पुनर्निर्माण, स्क्रीनिंग और विकास में उपयोग किया जाता है 1,2,3। पारंपरिक माइक्रोबियल खेती के तरीके मुख्य रूप से खेती के कंटेनरों के रूप में टेस्ट ट्यूब, शेक फ्लास्क और ठोस प्लेटों का उपयोग करते हैं, जो मिलाते हुए इनक्यूबेटर, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, माइक्रोप्लेट रीडर और माइक्रोबियल खेती, पता लगाने और स्क्रीनिंग के लिए अन्य उपकरणों के साथ संयुक्त होते हैं। हालांकि, इन तरीकों में कई समस्याएं हैं, जैसे बोझिल संचालन, कम थ्रूपुट, कम दक्षता, और श्रम और अभिकर्मकों की बड़ी खपत। हाल के वर्षों में विकसित उच्च-थ्रूपुट खेती के तरीके मुख्य रूप से माइक्रोप्लेट पर आधारित हैं। लेकिन माइक्रोप्लेट में भंग ऑक्सीजन, खराब मिश्रण संपत्ति, और गंभीर वाष्पीकरण और थर्मल प्रभाव का निम्न स्तर होता है, जो अक्सर खराब विकास की स्थिति और सूक्ष्मजीवों के समानांतरीकरण का प्रयोग करता है 4,5,6,7; दूसरी ओर, इसे महंगे उपकरणों से सुसज्जित करने की आवश्यकता है, जैसे कि तरल-हैंडलिंग वर्कस्टेशन और माइक्रोप्लेट रीडर, स्वचालित खेती और प्रक्रिया का पता लगानेके लिए 8,9 प्राप्त करने के लिए।

माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी की एक महत्वपूर्ण शाखा के रूप में, बूंद माइक्रोफ्लुइडिक्स को हाल के वर्षों में पारंपरिक निरंतर-प्रवाह माइक्रोफ्लुइडिक प्रणालियों के आधार पर विकसित किया गया है। यह एक असतत प्रवाह माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक है जो बिखरे हुए सूक्ष्म-बूंदों को उत्पन्न करने और उन पर काम करने के लिए दो immiscible तरल चरणों (आमतौर पर तेल-पानी) का उपयोग करतीहै। क्योंकि सूक्ष्म-बूंदों में छोटी मात्रा, बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र, उच्च आंतरिक द्रव्यमान हस्तांतरण दर, और कंपार्टमेंटलाइजेशन के कारण कोई क्रॉस-संदूषण नहीं होता है, और मजबूत नियंत्रण क्षमता और बूंदों के उच्च थ्रूपुट के फायदे होते हैं, इसलिए उच्च-थ्रूपुट खेती, स्क्रीनिंग और सूक्ष्मजीवों के विकास में ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक को लागू करने वाले कई प्रकार के शोध हुए हैं। . हालांकि, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक को लोकप्रिय और व्यापक रूप से लागू करने के लिए अभी भी प्रमुख मुद्दों की एक श्रृंखला है। सबसे पहले, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स का संचालन बोझिल और जटिल है, जिसके परिणामस्वरूप ऑपरेटरों के लिए उच्च तकनीकी आवश्यकताएं होती हैं। दूसरे, ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक ऑप्टिकल, मैकेनिकल और इलेक्ट्रिकल घटकों को जोड़ती है और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोग परिदृश्यों से जुड़ी होने की आवश्यकता है। एक एकल प्रयोगशाला या टीम के लिए कुशल बूंद माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण प्रणाली का निर्माण करना मुश्किल है यदि कोई बहु-अनुशासनात्मक सहयोग नहीं है। तीसरा, माइक्रो-ड्रॉपलेट की छोटी मात्रा (पिकोलिटर (पीएल) से माइक्रोलीटर (μL) तक) के कारण, कुछ बुनियादी माइक्रोबियल संचालन जैसे उप-खेती, छंटाई और नमूने के लिए बूंदों के सटीक स्वचालित नियंत्रण और वास्तविक समय ऑनलाइन पता लगाने का एहसास करने में बहुत कठिनाई होती है, और एक एकीकृत उपकरण प्रणाली12 का निर्माण करना भी मुश्किल है।

उपरोक्त समस्याओं को हल करने के लिए, एक स्वचालित माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) को ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक13 के आधार पर सफलतापूर्वक विकसित किया गया था। एमएमसी में चार कार्यात्मक मॉड्यूल होते हैं: एक बूंद पहचान मॉड्यूल, एक बूंद स्पेक्ट्रम का पता लगाने वाला मॉड्यूल, एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप मॉड्यूल, और एक नमूना मॉड्यूल। सभी मॉड्यूल के सिस्टम एकीकरण और नियंत्रण के माध्यम से, पीढ़ी, खेती, माप (ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) और प्रतिदीप्ति), विभाजन, संलयन, बूंदों की छंटाई सहित स्वचालित संचालन प्रणाली सटीक रूप से स्थापित की जाती है, जो माइक्रोबियल ड्रॉपलेट खेती की प्रक्रिया द्वारा आवश्यक टीकाकरण, खेती, निगरानी, उप-खेती, छंटाई और नमूनाकरण जैसे कार्यों के एकीकरण को प्राप्त करती है। एमएमसी 2-3 μL मात्रा की 200 प्रतिकृति बूंद खेती इकाइयों को पकड़ सकता है, जो 200 शेक फ्लास्क खेती इकाइयों के बराबर है। सूक्ष्म-बूंद खेती प्रणाली सूक्ष्मजीवों के विकास के दौरान गैर-संदूषण, भंग ऑक्सीजन, मिश्रण और द्रव्यमान-ऊर्जा विनिमय की आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है, और कई एकीकृत कार्यों के माध्यम से माइक्रोबियल अनुसंधान की विभिन्न जरूरतों को पूरा कर सकती है, उदाहरण के लिए, विकास वक्र माप, अनुकूली विकास, एकल कारक बहु-स्तरीय विश्लेषण, और मेटाबोलाइट अनुसंधान और विश्लेषण (प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आधार पर)13,14।

यहां, प्रोटोकॉल का परिचय है कि एमएमसी का उपयोग स्वचालित और माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास को विस्तार से करने के लिए कैसे किया जाए (चित्रा 1)। हमने विकास वक्र माप और एमएमसी में अनुकूली विकास को प्रदर्शित करने के लिए मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई स्ट्रेन MeSV2.2 15 को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में जंगली-प्रकार के Escherichia coli (ई कोलाई)MG1655 को लिया। एमएमसी के लिए एक ऑपरेशन सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था, जो ऑपरेशन को बहुत सरल और स्पष्ट बनाता है। पूरी प्रक्रिया में, उपयोगकर्ता को प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान तैयार करने, एमएमसी की शर्तों को सेट करने और फिर एमएमसी में बैक्टीरिया समाधान और संबंधित अभिकर्मकों को इंजेक्ट करने की आवश्यकता होती है। इसके बाद, एमएमसी स्वचालित रूप से ड्रॉपलेट जनरेशन, मान्यता और नंबरिंग, खेती और अनुकूली विकास जैसे संचालन करेगा। यह उच्च समय रिज़ॉल्यूशन के साथ बूंदों का ऑनलाइन पता लगाने (ओडी और प्रतिदीप्ति) भी करेगा और सॉफ़्टवेयर में संबंधित डेटा (जिसे निर्यात किया जा सकता है) प्रदर्शित करेगा। ऑपरेटर परिणामों के अनुसार किसी भी समय खेती की प्रक्रिया को रोक सकता है और बाद के प्रयोगों के लिए लक्ष्य बूंदों को निकाल सकता है। एमएमसी को संचालित करना आसान है, कम श्रम और अभिकर्मकों का उपभोग करता है, और अपेक्षाकृत उच्च प्रयोगात्मक थ्रूपुट और अच्छे डेटा समानता है, जिसमें पारंपरिक खेती विधियों की तुलना में महत्वपूर्ण फायदे हैं। यह शोधकर्ताओं को संबंधित माइक्रोबियल अनुसंधान करने के लिए एक कम लागत, संचालन के अनुकूल और मजबूत प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है।

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Protocol

1. साधन और सॉफ्टवेयर स्थापना

  1. एमएमसी के लिए एक समर्पित स्थायी स्थान के रूप में एक स्वच्छ और बाँझ वातावरण (जैसे कि एक साफ बेंच) चुनें। अंतरिक्ष में MMC को लगातार स्थापित करें।
    नोट: MMC को मजबूत विद्युत क्षेत्रों, चुंबकीय क्षेत्रों और मजबूत गर्मी विकिरण स्रोतों के हस्तक्षेप से दूर रखें। ऑप्टिकल डिटेक्शन घटकों को प्रभावित करने से गंभीर कंपन से बचें। एमएमसी को AC220 V, 50 HZ की बिजली की आपूर्ति प्रदान करें। एमएमसी पर विवरण के लिए सामग्री की तालिका और एमएमसी16 के लिए वेबसाइट देखें।
  2. MMC.zip फ़ाइल से कार्रवाई सॉफ़्टवेयर स्थापित करें
    नोट:: MMC.zip फ़ाइल के लिए लेखकों से संपर्क करें।
    1. एक समर्पित फ़ोल्डर बनाएँ और इसमें ज़िप फ़ाइल सहेजें।
    2. "स्थापना निर्देशिका" के रूप में कोई अन्य समर्पित फ़ोल्डर बनाएँ। MMC खोलें.zip और नए फ़ोल्डर में फ़ाइलों को सहेजें।
      नोट:: कंप्यूटर कॉन्फ़िगरेशन को पूरा करने के लिए सबसे अच्छा है: (1) Windows 7 64-बिट ऑपरेटिंग सिस्टम या उसके बाद के संस्करण; (2) सीपीयू: i5 या ऊपर; (3) स्मृति: 4 जीबी या उससे ऊपर; (4) हार्ड डिस्क: 300 जीबी या उससे ऊपर (घूर्णी गति 7200 आरपीएम या ठोस-राज्य डिस्क से अधिक)।

2. तैयारी

  1. सिरिंज सुई कनेक्ट करें (आंतरिक व्यास 0.41 मिमी है और बाहरी व्यास 0.71 मिमी है), त्वरित कनेक्टर ए, और अभिकर्मक बोतल (चित्रा 2 सी), और उन्हें 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें।
    नोट: नसबंदी के दौरान अभिकर्मक बोतल की टोपी को थोड़ा खोलें। उपयोग के लिए हर बार कुछ और अभिकर्मक बोतलें तैयार की जा सकती हैं।
  2. एमएमसी तेल को फ़िल्टर करने के लिए 0.22 μm polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) फ़िल्टर का उपयोग करें। माइक्रोफ्लुइडिक चिप (चित्रा 2 बी) और एमएमसी तेल को पहले से ही साफ बेंच में रखें और उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण द्वारा उन्हें निष्फल करें।
    नोट: त्वरित कनेक्टर ए, अभिकर्मक बोतल, एमएमसी तेल और माइक्रोफ्लुइडिक चिप के विवरण के लिए सामग्री की तालिका को देखें।
  3. माइक्रोफ्लुइडिक चिप स्थापित करें
    1. ऑपरेशन चैंबर (चित्रा 2 ए) का दरवाजा खोलें और ऑप्टिकल फाइबर जांच उठाएं।
    2. इलेक्ट्रिक फील्ड सुइयों के साथ इलेक्ट्रिक फील्ड होल को संरेखित करें और चिप को धीरे से चिप पेडस्टल पर रखें। फिर स्थिति छेद में दो पोजिशनिंग कॉलम डालें और ऑप्टिकल फाइबर प्रोब (चित्रा 2 डी) को नीचे रखें।
    3. स्थिति संख्या (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3) के अनुसार MMC के संबंधित पोर्ट के लिए चिप पर त्वरित कनेक्टर A कनेक्ट करें। फिर ऑपरेशन चैंबर का दरवाजा बंद कर दें।
  4. तेल की बोतल में एमएमसी तेल (लगभग 80 मिलीलीटर) को फिर से भरें और उपयोग से पहले अपशिष्ट बोतल में अपशिष्ट तरल को खाली करें।
    नोट: अपशिष्ट तरल आमतौर पर कार्बनिक अपशिष्ट है। कृपया निपटान पर क्षेत्रीय कानून और विनियमन का संदर्भ लें, प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर परिवर्तन के अधीन।

3. MMC में विकास वक्र माप

  1. प्रारंभिक जीवाणु समाधान के लिए तैयारी
    1. लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम तैयार करने के लिए संबंधित मानक नियमों का पालन करें और 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें।
      नोट: एलबी माध्यम के घटक: NaCl (10 ग्राम / एल), खमीर निकालने (5 ग्राम / एल) और tryptone (10 ग्राम / एल)।
    2. ग्लिसरॉल स्टॉक से ई कोलाई MG1655 तनाव को बाहर निकालें और इसे 5-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर (200 आरपीएम) में एलबी माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ 50 मिलीलीटर शेक फ्लास्क में खेती करें।
      नोट: खेती का समय विशिष्ट उपभेदों पर निर्भर करता है। लॉगरिदमिक अवधि / चरण के लिए तनाव की खेती करना इष्टतम है।
    3. एक प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान (लगभग 10 एमएल तैयार करें) प्राप्त करने के लिए0.05-0.1 के ओडी 600 के लिए ताजा माध्यम के साथ सुसंस्कृत ई कोलाई MG1655 समाधान को पतला करें।
  2. MMC प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ पर क्लिक करें। प्रारंभ इंटरफ़ेस प्रकट होने के बाद, खेती के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और फोटोइलेक्ट्रिक सिग्नल मान को 0.6 (चित्रा 3 ए) के रूप में सेट करें। आरंभ करने में लगभग 20 मिनट का समय लगेगा।
  3. प्रारंभ के दौरान यूवी लैंप (तरंग दैर्ध्य 254 एनएम) को चालू करें।
  4. अभिकर्मक बोतल में प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान और एमएमसी तेल इंजेक्ट करें।
    1. साफ बेंच पर एक निष्फल अभिकर्मक बोतल बाहर ले लो और टोपी कस.
    2. साइड ट्यूब की सिरिंज सुई से एमएमसी तेल के 3-5 मिलीलीटर इंजेक्ट करने के लिए 10 एमएल बाँझ सिरिंज का उपयोग करें। तेल को पूरी तरह से आंतरिक दीवार में घुसपैठ करने के लिए अभिकर्मक बोतल को धीरे-धीरे झुकाएं और घुमाएं।
    3. प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान के बारे में 5 मिलीलीटर इंजेक्ट करें, और फिर फिर से तेल के 5-7 मिलीलीटर इंजेक्ट करके अभिकर्मक की बोतल को भरें।
    4. स्वतंत्र त्वरित कनेक्टर ए को बाहर निकालें, और नमूना इंजेक्शन ऑपरेशन (चित्रा 4 ए) को पूरा करने के लिए अपने त्वरित कनेक्टर बी में अभिकर्मक बोतल के त्वरित कनेक्टर ए डालें।
  5. प्रारंभ समाप्त होने की प्रतीक्षा करें और फिर यूवी लैंप (तरंग दैर्ध्य 254 एनएम) को बंद कर दें।
  6. ऑपरेशन चैंबर का दरवाजा खोलें, और अभिकर्मक की बोतल को धातु स्नान में डालें।
  7. चिप के C2 कनेक्टर और अभिकर्मक बोतल के त्वरित कनेक्टर ए को बाहर निकालें। अभिकर्मक बोतल के साइड ट्यूब कनेक्टर को C2 कनेक्टर और O2 कनेक्टर के लिए शीर्ष ट्यूब कनेक्टर से कनेक्ट करें। फिर ऑपरेशन चैंबर का दरवाजा बंद कर दें।
  8. विकास वक्र माप (चित्रा 3A) के कार्य को चुनने के लिए विकास वक्र पर क्लिक करें। पैरामीटर सेटिंग इंटरफ़ेस में, संख्या को 15 के रूप में इनपुट करें, OD डिटेक्शन स्विच चालू करें और तरंग दैर्ध्य को 600 nm के रूप में सेट करें. ड्रॉपलेट जनरेशन शुरू करने के लिए Start पर क्लिक करें। इसमें लगभग 10 मिनट का समय लगेगा।
    नोट:: यहाँ, संख्या उत्पन्न करने के लिए बूंदों की संख्या को संदर्भित करता है। तरंग दैर्ध्य ओडी की तरंग दैर्ध्य को संदर्भित करता है जिसका पता लगाया जाना है। प्रयोग आवश्यकताओं के अनुसार संख्या (अधिकतम 200) और तरंग दैर्ध्य (350-800 एनएम) सेट करें।
  9. जब मुख्य इंटरफ़ेस पर एक पॉप-अप विंडो दिखाई देती है, तो "C2 और O2 के बीच अभिकर्मक बोतल निकालें, फिर पूरा होने के बाद ठीक बटन पर क्लिक करें", अभिकर्मक बोतल को बाहर निकालने और C2 और O2 कनेक्टर्स को कनेक्ट करने के लिए ऑपरेशन चैंबर का दरवाजा खोलें।
  10. दरवाजा बंद करें, और स्वचालित रूप से बूंदों को खेती करने और OD मानों का पता लगाने के लिए पॉप-अप विंडो में ठीक बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: MMC OD मान का पता लगाता है जब ड्रॉपलेट ऑप्टिकल फाइबर प्रोब पास करता है। इसलिए, पता लगाने की अवधि उत्पन्न बूंदों की संख्या पर निर्भर करती है।
  11. जब वृद्धि वक्र स्थिर चरण तक पहुँच जाता है, तो OD डेटा निर्यात करने के लिए डेटा निर्यात बटन क्लिक करें. डेटा सहेजें पथ का चयन करें और .csv स्वरूप में खेती अवधि के दौरान दर्ज OD मान निर्यात करें, जिसे उपयुक्त सॉफ़्टवेयर (जैसे, Microsoft Excel) द्वारा खोला जा सकता है. फिर विकास वक्र को प्लॉट करने के लिए एक मैपिंग सॉफ़्टवेयर (उदाहरण के लिए, EXCEL और Origin 9.0) का उपयोग करें।
    नोट:: खेती की प्रक्रिया के दौरान, सभी वर्तमान बूंदों के OD डेटा निर्यात करने के लिए किसी भी समय डेटा निर्यात पर क्लिक करना संभव है।

4. एमएमसी में अनुकूली विकास

  1. प्रारंभिक जीवाणु समाधान के लिए तैयारी
    1. MeSV2.2 के लिए विशेष तरल मध्यम और ठोस प्लेटों को तैयार करने के लिए संबंधित मानक नियमों का पालन करें और 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव करें।
      नोट:: विशेष माध्यम के घटकों के लिए तालिका 1 और सामग्री की तालिका देखें।
    2. 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्थिर तापमान इनक्यूबेटर में ठोस प्लेट (व्यास = 90 मिमी) का उपयोग करके MeSV2.2 की खेती करें। फिर एक स्वतंत्र कॉलोनी चुनें और इसे 50 मिलीलीटर शेक फ्लास्क में खेती करें, जिसमें 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर (200 आरपीएम) में विशेष तरल माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ खेती की जाती है।
    3. 0.1-0.2 के ओडी 600 के लिए माध्यम के साथ सुसंस्कृत MeSV2.2 समाधान को पतला करें (सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 10 मिलीलीटर से कम नहीं है) और प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान प्राप्त करने के लिए 5 घंटे के लिए शेक फ्लास्क में इसकी खेती जारी रखें।
      नोट: MeSV2.2 एक मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई तनाव है। विशेष तरल माध्यम में 500 mmol / L मेथनॉल होता है, जो MeSV2.2 के लिए एक मजबूत तनाव है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत धीमी गति से विकास होता है। ध्यान दें कि यहां प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान प्राप्त करना चरण 3.1 में वर्णित से अलग है।
  2. चरण 3.2, 3.3, और 3.5 में समझाया गया के रूप में MMC प्रारंभ करें।
  3. दो निष्फल अभिकर्मक बोतलों को बाहर निकालें, जिनमें से एक प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान के लिए है और दूसरा ताजा माध्यम के लिए है। प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान (5 एमएल), ताजा माध्यम (12-15 एमएल), और एमएमसी तेल को अभिकर्मक बोतलों में इंजेक्ट करें जैसा कि चरण 3.4 में समझाया गया है।
    नोट: चूंकि अनुकूली विकास एक दीर्घकालिक प्रक्रिया है जिसमें कई उप-खेती शामिल हैं, इसलिए एमएमसी में जितना संभव हो उतना ताजा माध्यम स्टोर करें। प्रयोग चलने के दौरान माध्यम को फिर से नहीं भरा जा सकता है।
  4. चरण 3.6 में समझाया गया के रूप में MMC में दो अभिकर्मक बोतलों को स्थापित करें। C2 और O2 कनेक्टर के बीच प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान के लिए एक स्थापित करें और C4 और O4 कनेक्टर के बीच ताजा माध्यम के लिए दूसरा।
  5. अनुकूली विकास (चित्रा 3 बी) के कार्य को चुनने के लिए एएलई पर क्लिक करें। पैरामीटर सेटिंग इंटरफ़ेस में, OD डिटेक्शन स्विच चालू करें।
  6. संख्या को 50 के रूप में, तरंग दैर्ध्य को 600 एनएम के रूप में, एकाग्रता को 0% के रूप में, प्रकार समय के रूप में, पैरामीटर को 30 घंटे के रूप में और पुनरावृत्ति को 99 के रूप में सेट करें। ड्रॉपलेट जनरेशन शुरू करने के लिए Start पर क्लिक करें। इसमें लगभग 25 मिनट का समय लगेगा।
    नोट: यहाँ, "एकाग्रता" अनुकूली विकास के लिए रासायनिक कारकों की अधिकतम एकाग्रता को संदर्भित करता है। विभिन्न बूंदों के लिए, एमएमसी में विभिन्न विकास स्थितियों को प्रदान करने के लिए रासायनिक कारकों की विभिन्न सांद्रता को पेश करना साकार होता है। निम्न समीकरण का उपयोग करके पेश की गई सांद्रता की गणना करें:
    Equation 1
    यहां "सी" बूंदों में पेश किए गए रासायनिक कारकों की एकाग्रता को संदर्भित करता है; "ए" सी 4 और ओ 4 कनेक्टर के बीच अभिकर्मक बोतलों में रासायनिक कारकों की एकाग्रता को संदर्भित करता है; "बी" सी 6 और ओ 6 कनेक्टर के बीच अभिकर्मक बोतलों में रासायनिक कारकों की एकाग्रता को संदर्भित करता है; और "i" उपलब्ध एकाग्रता को संदर्भित करता है। एमएमसी में आठ सांद्रता उपलब्ध हैं। चूंकि यहां रासायनिक कारक में एक एकल एकाग्रता (500 mmol / L मेथनॉल) है और यह माध्यम की सामग्री में से एक है, इसलिए रासायनिक कारक वाली केवल एक अभिकर्मक बोतल यहां स्थापित की गई है, और एकाग्रता को 0% के रूप में सेट किया गया है। प्रकार उप-खेती की विधा को संदर्भित करता है, जिसे तीन प्रकारों में विभाजित किया जाता है: समय मोड, ओडी मूल्य मोड और प्रतिदीप्ति मोड। पूर्व का मतलब है कि एक निश्चित समय के लिए बूंदों की खेती करना और फिर उप-खेती करना, जबकि बाद के दो का मतलब है कि बूंदों को पूर्व-परिभाषित ओडी मूल्य / प्रतिदीप्ति तीव्रता और फिर उप-खेती करने के लिए खेती करना। पैरामीटर उप-खेती के मोड का चयन करते समय आवश्यक संबंधित पैरामीटर को संदर्भित करता है। पुनरावृत्ति उप-खेती की संख्या को संदर्भित करता है।
  7. चरण 3.8 में बताए गए अनुसार C2 और O2 कनेक्टर के बीच रखी अभिकर्मक बोतल को निकालें।
  8. देखें कि प्रत्येक उप-खेती अवधि के दौरान बूंदों के अधिकतम ओडी मूल्यों में काफी वृद्धि हुई है या नहीं। यदि वृद्धि होती है और प्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करती है, तो चरण 3.9 में बताए गए अनुसार OD डेटा निर्यात करने के लिए डेटा निर्यात बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: यहाँ, उप-खेती अवधि पैरामीटर पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, जब प्रकार को समय के रूप में सेट करते हैं और पैरामीटर 30 h के रूप में, उप-खेती अवधि 30 h है। प्रत्येक उप-खेती अवधि के दौरान, बूंदों के अधिकतम ओडी मान होते हैं। अनुमान लगाएं कि क्या अनुकूली विकास अधिकतम ओडी मूल्यों की वृद्धि से प्रयोग आवश्यकताओं को पूरा करता है (वृद्धि तनाव की वास्तविक खेती प्रक्रिया पर निर्भर करती है, उदाहरण के लिए, 20% से अधिक की वृद्धि हुई है)।
    सावधानी: ध्यान दें कि क्या संग्रहीत ताजा माध्यम समाप्त हो गया है। यदि माध्यम समाप्त होने के बाद भी महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हुई है, तो बेहतर बढ़ती बूंदों को निकालें और अनुकूली विकास का एक नया दौर करें।
  9. MMC से लक्ष्य बूंदों को निकालें।
    1. ड्रॉपलेट निष्कर्षण (चित्रा 3 सी) के कार्य को चुनने के लिए स्क्रीनिंग बटन पर क्लिक करें। लीजिए विकल्प चुनें, लक्ष्य बूंदों की संख्या पर क्लिक करें, और फिर ठीक पर क्लिक करें।
      नोट:: ड्रॉपलेट स्क्रीनिंग "इकट्ठा करें", "छोड़ें" और "निकालें बीज समाधान" शामिल हैं। "निकालें बीज समाधान" उप-खेती ऑपरेशन के बाद शेष बूंदों13 को इकट्ठा करने का मतलब है।
    2. संकेत करने के लिए पॉप-अप विंडो के लिए प्रतीक्षा करें, "कृपया सीएफ त्वरित कनेक्टर को बाहर निकालें और इसे ईपी ट्यूब में डालें"। सॉफ्टवेयर प्रॉम्प्ट के अनुसार संग्रह के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में CF त्वरित कनेक्टर रखो और फिर ठीक (चित्रा 4 डी) पर क्लिक करें।
    3. 1-2 मिनट के बाद, सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस एक नई विंडो को पॉप अप करेगा, "कृपया कनेक्टर को वापस डालें और समाप्त होने पर ठीक पर क्लिक करें"। उसके बाद, CF त्वरित कनेक्टर वापस डालें और MMC को चलाने के लिए जारी रखने के लिए ठीक पर क्लिक करें (चित्रा 4D)। जब अगली लक्ष्य बूंद ड्रॉपलेट पहचान साइट तक पहुंच जाती है, तो इसे इकट्ठा करने के लिए 4.9.2-4.9.3 दोहराएं।
      नोट:: सभी लक्ष्य बूंदों को एकत्र करने के बाद, MMC शेष बूंदों की खेती जारी रखेगा। यदि खेती आवश्यक नहीं है, तो ऑपरेशन को सीधे समाप्त करने के लिए रोकें पर क्लिक करें।
    4. एक 2.5 μL पिपेट का उपयोग करके बूंद निकालें, इसे 90 मिमी agarose प्लेट पर छोड़ दें, और इसे 3 सेमी की एक तरफ की लंबाई के साथ एक त्रिकोणीय ग्लास फैलाने वाली रॉड के साथ समान रूप से फैलाएं। फिर इसे 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्थिर तापमान इनक्यूबेटर में खेती करें।
    5. 3-5 स्वतंत्र कॉलोनियों को चुनें और अलग से उन्हें 50 मिलीलीटर शेक फ्लास्क में 48-72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर (200 आरपीएम) में 10 मिलीलीटर ताजा माध्यम के साथ खेती करें। बाद के प्रयोगों के लिए ग्लिसरॉल ट्यूब में सुसंस्कृत बैक्टीरिया समाधान को संग्रहीत करने के लिए संबंधित मानक नियमों का पालन करें।

5. एमएमसी की सफाई

  1. प्रयोग पूरा होने के बाद, सभी ऑपरेशनों को रोकने के लिए रोकें पर क्लिक करें। फिर चिप और ट्यूब को साफ करने के लिए क्लीन पर क्लिक करें। इसमें लगभग 15 मिनट का समय लगेगा।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल ई कोलाई MG1655 और एक MeSV2.2 तनाव का उपयोग उदाहरण के रूप में करता है ताकि एमएमसी में एक स्वचालित और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट रणनीति के साथ माइक्रोबियल खेती और मेथनॉल-आवश्यक अनुकूली विकास का प्रदर्शन किया जा सके। विकास वक्र माप का उपयोग मुख्य रूप से माइक्रोबियल खेती को चिह्नित करने के लिए किया गया था। अनुकूली विकास स्वचालित निरंतर उप-खेती द्वारा आयोजित किया गया था और प्रत्येक उप-खेती के दौरान चयनात्मक दबाव के रूप में मेथनॉल की एक उच्च एकाग्रता को जोड़ना था। क्या अनुकूली विकास को महसूस किया गया था, प्रत्येक उप-खेती अवधि के दौरान बूंदों के अधिकतम ओडी मूल्य की भिन्नता प्रवृत्ति के माध्यम से अनुमान लगाया गया था। MMC के tunable पैरामीटर और सटीकता पैरामीटर तालिका 2 में दिखाए गए हैं।

वृद्धि वक्र माप के परिणाम
खेती की प्रक्रिया के दौरान पता लगाए गए 15 बूंदों के ओडी600 मूल्यों को लगभग 20 घंटे (चित्रा 5 ए) के लिए खेती करने के बाद एमएमसी से निर्यात किया गया था। यह देखा जा सकता है कि पता लगाने लगभग हर 14 मिनट में आयोजित किया गया था। यह पता लगाने की अवधि उत्पन्न बूंदों की संख्या पर निर्भर करती है क्योंकि बूंदों को खेती के लिए ट्यूबों में आगे और पीछे चक्रित किया जाता है, और डिटेक्शन मॉड्यूल केवल ओडी मानों का पता लगाता है (ओडी मान का पता लगाने और गणना पूरक चित्र1 में दिखाई जाती है) जब बूंदें ऑप्टिकल फाइबर जांच से गुजरती हैं। इसलिए, 14 मिनट एक बहुत ही छोटी पहचान अवधि है, जो सूक्ष्मजीवों के विकास को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने के लिए एक उच्च समय रिज़ॉल्यूशन डिटेक्शन प्रक्रिया प्रदान करती है।

निर्यात किए गए आंकड़ों के अनुसार, प्रत्येक समय बिंदु पर 15 बूंदों के औसत OD600 मान और मानक विचलन (एसडी) की गणना की गई थी, और ई कोलाई MG1655 के विकास वक्र को प्लॉट किया गया था (चित्रा 5B)। परिणामों से पता चलता है कि विकास वक्र एक "एस" आकार प्रस्तुत करता है, जिसमें अंतराल चरण, लॉगरिदमिक चरण और स्थिर चरण शामिल हैं, जो क्लासिक माइक्रोबियल विकास मॉडल के साथ बहुत सुसंगत है। इसी समय, 15 बूंदों के मानक विचलन बहुत छोटे होते हैं, जो अच्छी विकास स्थिरता और समानता का संकेत देते हैं। इस प्रकार, यह पूरी तरह से अच्छी माइक्रोबियल खेती और एमएमसी के पता लगाने के प्रदर्शन को दर्शाता है। इसके अलावा, यह भी सत्यापित किया गया था कि खेती के दौरान बूंदों के बीच बहुत कम क्रॉसस्टॉक होता है (पूरक चित्र2 और पूरक तालिका 1)।

अनुकूली विकास के परिणाम
हमने एमएमसी में MeSV2.2 का दीर्घकालिक अनुकूली विकास किया है। 18वें दिन, सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर प्रदर्शित विकास वक्रों से प्रत्येक उप-खेती की अवधि के दौरान बूंदों के अधिकतम ओडी600 मूल्यों की बढ़ती प्रवृत्ति के अनुसार, हमारा मानना था कि 50 बूंदों में एक अच्छा अनुकूली विकास हासिल किया गया था। ओडी600 डेटा निर्यात किया गया था और अपेक्षाकृत अच्छे विकास प्रदर्शन के साथ 8 बूंदों (ड्रॉपलेट 6 सहित) को निकाला गया था। चित्रा 6A पूरे अनुकूली विकास प्रक्रिया में 50 बूंदों के विकास वक्रों को दर्शाता है। 18 दिनों में, एमएमसी ने स्वचालित रूप से 13 उप-खेती कार्यों को अंजाम दिया है। यह चित्रा 6A से देखा जा सकता है कि MeSV2.2 धीरे-धीरे पहले और बाद में तेजी से बढ़ता है, जो MeSV2.2 में अनुकूली विकास के ट्रैक को इंगित करता है। एक चयन दबाव की आपूर्ति करने के लिए, मेथनॉल को MeSV2.2 माध्यम में जोड़ा गया था। प्रारंभ में, मेथनॉल ने कोशिका विकास को रोक दिया। अनुकूली विकास के बाद, मेथनॉल के अनुकूलित समृद्ध कोशिकाओं में उच्च विकास दर थी। पूरी अनुकूली विकास प्रक्रिया में ड्रॉपलेट 6 के विकास वक्र को अलग से प्लॉट किया गया था (चित्रा 6 बी)। पहली पीढ़ी और अंतिम उप-खेती की अवधि में अधिकतमOD 600 मान क्रमशः 0.37 और 0.58 थे, जिसमें 56.8% की वृद्धि हुई। यह इंगित करता है कि ड्रॉपलेट 6 में तनाव ने एक स्पष्ट अनुकूली विकास का एहसास किया है।

इसके बाद, ड्रॉपलेट 6 स्ट्रेन और शेक फ्लास्क में प्रारंभिक तनाव की खेती की गई, और उनके विकास वक्रों की तुलना की गई (चित्रा 6 सी)। साहित्य17,18 में दी गई विधियों के अनुसार, ड्रॉपलेट 6 स्ट्रेन की अधिकतम विशिष्ट विकास दर (अधिकतम μ) और प्रारंभिक तनाव की गणना की गई थी, जो क्रमशः 0.096 एच -1 और 0.072 एच -1 थे। चित्रा 6 सी से पता चलता है कि ड्रॉपलेट 6 स्ट्रेन ने एक उच्च अधिकतम विशिष्ट विकास दर (54.8% की वृद्धि) का प्रदर्शन किया और शेक फ्लास्क में खेती किए जाने पर प्रारंभिक तनाव की तुलना में स्थिर चरण (20.0% की वृद्धि) में उच्च सेल एकाग्रता थी, जिसने आगे सुझाव दिया कि MeSV2.2 में अनुकूली विकास का एहसास हुआ है।

Figure 1
चित्रा 1: विकास वक्र माप और MMC में अनुकूली विकास के समग्र वर्कफ़्लो. (ए) एमएमसी में वृद्धि वक्र माप। सबसे पहले, प्रारंभिक जीवाणु समाधान तैयार करने के लिए शेक फ्लास्क में तनाव की खेती करें। फिर, अभिकर्मक बोतल में प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान इंजेक्ट करें। अगला, एमएमसी में बूंदों को उत्पन्न करें। एमएमसी उन्हें खेती करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चिप और ट्यूबों में बूंदों को आगे और पीछे चक्र बनाता है। जब ड्रॉपलेट्स डिटेक्शन साइट को पास करते हैं, तो OD डेटा का पता लगाया जाएगा और रिकॉर्ड किया जाएगा। अंत में, विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करें। (बी) एमएमसी में अनुकूली विकास। agarose प्लेट से एक एकल कॉलोनी चुनें और प्रारंभिक जीवाणु समाधान तैयार करने के लिए एक शेक फ्लास्क में इसकी खेती करें। अभिकर्मक बोतल में प्रारंभिक बैक्टीरिया समाधान को इंजेक्ट करने के बाद, एमएमसी में अनुकूली विकास का संचालन करें। अनुकूली विकास में निरंतर उप-खेती शामिल है, जिसे बूंद विभाजन और संलयन के माध्यम से स्वचालित रूप से संचालित किया जा सकता है। अनुकूली विकास के बाद, विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करें। लक्ष्य बूंदों को निकाला जा सकता है और फिर एकल उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए प्लेट पर फैलाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: संरचना और MMC के आवश्यक उपकरण. (ए) एमएमसी के बाहरी और संचालन कक्ष। (बी) एमएमसी की माइक्रोफ्लुइडिक चिप। चिप में सात चैनल (C1-C6 और CF) हैं। (c) अभिकर्मक बोतल। इसमें एक टॉप ट्यूब और एक साइड ट्यूब है। अभिकर्मक बोतल में नमूने को इंजेक्ट करने से पहले, इसे पहले एक सिरिंज सुई को एक त्वरित कनेक्टर ए से कनेक्ट करने और फिर त्वरित कनेक्टर ए को साइड ट्यूब से कनेक्ट करने की आवश्यकता होती है। (d) माइक्रोफ्लुइडिक चिप की स्थापना। माइक्रोफ्लुइडिक चिप पेडस्टल पर स्थापित है। फिर सात चैनल (C1-C6 और CF) क्रमशः MMC (O1-O6, और OF) के संबंधित बंदरगाहों से जुड़े होते हैं।

1 - एमएमसी के ऑपरेशन चैंबर।
2 - एमएमसी तेल युक्त तेल की बोतल।
3 - अपशिष्ट तरल एकत्र करने के लिए अपशिष्ट बोतल।
4 - नसबंदी के लिए यूवी लैंप (तरंग दैर्ध्य 254 एनएम)। चिप और ट्यूबों को निष्फल करने के लिए इस लैंप को पहले से चालू किया जा सकता है।
5 - ड्रॉपलेट पहचान के लिए लेजर (620 एनएम)। वह बिंदु जहां लेजर चिप पर विकिरणित होता है, वह बूंद पहचान साइट है।
6 - ऑपरेशन कक्ष के अंदर तापमान को मापने के लिए तापमान जांच।
7 - ऑपरेशन कक्ष के लिए हीटर. इसका उपयोग माइक्रोबियल खेती के तापमान को बनाए रखने के लिए किया जा सकता है। सेट किए जा सकने वाले तापमान की सीमा 25 ± 0.5 °C से 40 ± 0.5 °C है।
8 - ऑप्टिकल फाइबर जांच बूंदों के OD या प्रतिदीप्ति को मापने के लिए।
9 - माइक्रोफ्लुइडिक चिप स्थापित करने के लिए चिप पेडस्टल।
10 - धातु स्नान अभिकर्मक बोतलों को ठीक करने के लिए और उन्हें गर्म करने के लिए जल्दी से माइक्रोबियल खेती के तापमान के लिए एक अभिकर्मक के तापमान को बढ़ाने के लिए।
11 - माइक्रोफ्लुइडिक चिप (O1-O6, और OF) के लिए बंदरगाहों. माइक्रोफ्लुइडिक चिप इन बंदरगाहों के माध्यम से एमएमसी से जुड़ा हुआ है।
12 - बूंद भंडारण और खेती के लिए ट्यूबों.
13 - चुंबक ब्लॉकों जल्दी से स्थापना के दौरान microfluidic चिप का पता लगाने के लिए.
14 - सिरिंज सुई अभिकर्मक बोतलों में नमूनों को इंजेक्ट करने के लिए। इसका आंतरिक व्यास 0.41 मिमी है, और इसका बाहरी व्यास 0.71 मिमी है।
15 - त्वरित कनेक्टर ए त्वरित कनेक्टर बी के साथ कनेक्ट करें।
16 - त्वरित कनेक्टर बी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमएमसी के ऑपरेशन सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस. (ए) सॉफ्टवेयर का मुख्य इंटरफ़ेस। (1) ऑपरेशन कक्ष में तापमान। (2) ड्रॉपलेट मान्यता का फोटोइलेक्ट्रिक सिग्नल मूल्य। जब ड्रॉपलेट गुजरता है, तो सिग्नल मान उच्च होता है (>2 वी)। जब तेल गुजरता है, तो सिग्नल मान कम होता है (<1 वी)। (3) समारोह चयन. चुनने के लिए चार कार्य हैं: विकास वक्र माप (विकास वक्र), अनुकूली प्रयोगशाला विकास (एएलई), एकल कारक बहु-स्तरीय विश्लेषण (एक-कारक) और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं (अनुकूलन) के अनुसार संचालन को अनुकूलित करना। (4) पैरामीटर सेटिंग इंटरफ़ेस. एक फ़ंक्शन चुनने के बाद यहां संबंधित प्रयोगात्मक पैरामीटर सेट करें। (5) कमांड रन क्षेत्र। (6) कैमरे का स्विच। कैमरा सीधे चिप के ऊपर स्थापित किया गया है, जिसका उपयोग चिप में बूंदों को ऑनलाइन देखने के लिए किया जा सकता है। (7) प्रक्रिया प्रदर्शन क्षेत्र. चल रहे समय, डेटा की निगरानी, और निष्पादित की जा रही कार्रवाई दिखाता है. (बी) अनुकूली विकास का पैरामीटर सेटिंग इंटरफ़ेस। (C) ड्रॉपलेट स्क्रीनिंग इंटरफ़ेस। एमएमसी स्वचालित रूप से बूंदों को नंबर कर सकता है। यहां लक्ष्य बूंदों का चयन किया जा सकता है और एमएमसी से निकाला जा सकता है। (डी) कैमरा अवलोकन इंटरफ़ेस. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नमूना इंजेक्शन, बूंद पीढ़ी, और बूंद निष्कर्षण. (ए) बैक्टीरिया समाधान और एमएमसी तेल के इंजेक्शन के बाद अभिकर्मक की बोतल। दोनों बैक्टीरिया समाधान और एमएमसी तेल साइड ट्यूब से इंजेक्ट किए जाते हैं। तेल चरण ऊपरी परत में है और बैक्टीरिया समाधान निचली परत में है। इंजेक्शन के बाद, त्वरित कनेक्टर A और B कनेक्ट करें, और तब इसे MMC में स्थापित करें। (बी) माइक्रोफ्लुइडिक चिप में ड्रॉपलेट उत्पादन। बूंदों की दृश्यता को बढ़ाने के लिए, बूंद पीढ़ी की प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए एक लाल वर्णक समाधान का उपयोग किया गया था। (c) सूक्ष्मदर्शी द्वारा देखी गई ट्यूब में संग्रहीत बूंद। स्केल बार: 400 μm. (डी) पॉप-अप विंडो संकेत देता है और इसी कार्रवाई। जब प्रॉम्प्ट "कृपया सीएफ त्वरित कनेक्टर को बाहर निकालें और इसे ईपी ट्यूब में डालें" दिखाई देता है, तो सीएफ कनेक्टर को बाहर निकालें और लक्ष्य बूंद को इकट्ठा करने के लिए इसे ईपी ट्यूब में डालें; जब प्रॉम्प्ट "कृपया कनेक्टर वापस डालें" प्रकट होता है, तो ड्रॉपलेट संग्रह पूरा हो जाता है, CF कनेक्टर को वापस OF पोर्ट में डालें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: डेटा निर्यात और विकास वक्र के आंकड़े प्लॉटिंग. (ए) निर्यात किए गए डेटा के हिस्से का स्क्रीनशॉट। निर्यात किए गए डेटा में 15 जनरेट की गई बूंदों और संबंधित OD600 मानों का प्रत्येक डिटेक्शन टाइम पॉइंट शामिल है। (ख) निर्यातित आंकड़ों के आधार पर ई कोलाई एमजी1655 की वृद्धि वक्र की योजना बनाई गई है। प्रत्येक समय बिंदु पर 15 बूंदों के औसत OD600 मानों और मानक विचलन (SD) की गणना करें और विकास वक्र को प्लॉट करें। यह देखने के लिए स्पष्ट है कि इस विकास वक्र में अंतराल चरण, लॉगरिदमिक चरण और स्थिर चरण शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एमएमसी में MeSV 2.2 के अनुकूली विकास के परिणाम। (ए) संपूर्ण अनुकूली विकास प्रक्रिया में 50 बूंदों की वृद्धि वक्र। 18-दिवसीय अनुकूली विकास प्रक्रिया के दौरान 50 बूंदों के OD600 डिटेक्शन डेटा को MMC से निर्यात किया गया था और प्लॉट किया गया था। 18 वें दिन, ड्रॉपलेट 6 सहित 8 बूंदों को निकाला गया था। (बी) पूरी अनुकूली विकास प्रक्रिया में बूंद 6 की वृद्धि वक्र। पहली पीढ़ी और अंतिम उप-खेती की अवधि में अधिकतमOD 600 मान क्रमशः 0.37 और 0.58 थे, जिसमें 56.8% की वृद्धि हुई। (सी) ड्रॉपलेट 6 स्ट्रेन और शेक फ्लास्क में प्रारंभिक तनाव की तुलना। ड्रॉपलेट 6 के तनाव और प्रारंभिक तनाव को शेक फ्लास्क में खेती की गई थी, और विकास वक्र (एसडी, एन = 3 सहित) को मापा गया था। इस आंकड़े को Jian X. J. et al.13 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक एकाग्रता
Na2HPO4·12H2O 6.78 g/L
KH2PO4 3 g/L
NaCl 0.5 g/L
NH4Cl 1 g/L
विटामिन बी 1 (निस्पंदन द्वारा निष्फल) 0.34 g/L
MgSO4·7H2O 0.049 g/L
CaCl2·2H2O 1.5 mg/L
Microelements:
FeCl3·6H2O 0.5 mg/L
ZnSO4·7H2O 0.09 mg/L
CuSO4·5H2O 0.088 mg/L
MnCl2 0.045 mg/L
CoCl2·6H2O 0.09 mg/L
ग्लूकोनेट 1.09 g/L
मेथनॉल 500 mmol/L
आइसोप्रोपिल-β-डी-थायोगैलैक्टोपायरेनोसाइड 0.1 mmol/L
स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट 20 μg/mL
कानामाइसिन सल्फेट 50 μg/mL
ठोस माध्यम तैयार करने के लिए अतिरिक्त 15 ग्राम / एल agarose जोड़ें।

तालिका 1: MeSV2.2 के लिए विशेष माध्यम के घटक।

Tunable पैरामीटर
प्राचल श्रेणी
खेती का तापमान 25–40 °C ± 0.5 °C
बूंदों की संख्या 0–200
इनोकुलम की सांद्रता 13.3–86.7 %
रासायनिक कारक की सांद्रता 8 अलग-अलग सांद्रता, संग्रहीत रासायनिक कारक की अधिकतम एकाग्रता तक
उप-खेती का समय उपयोगकर्ता तक
उप-खेती की संख्या उपयोगकर्ता तक
OD का पता लगाने की तरंग दैर्ध्य 350–800 nm
प्रतिदीप्ति संसूचन तरंग दैर्ध्य उत्तेजना: 470, 528 एनएम
उत्सर्जन: 350-800 एनएम
सटीकता पैरामीटर
प्राचल C.V.
बूंदों की मात्रा 1.88%
इनोकुलम की सांद्रता <5.0%

तालिका 2: MMC के Tunable पैरामीटर और सटीकता पैरामीटर। Tunable पैरामीटर उन पैरामीटरों को संदर्भित करते हैं जिन्हें उपयोगकर्ताओं की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है; सटीकता पैरामीटर उन मापदंडों को संदर्भित करते हैं जो विभिन्न तरल पदार्थों के संचालन की सटीकता और पुनरुत्पादन को दर्शाते हैं।

अनुपूरक चित्रा 1: एमएमसी में बूंदों की पहचान और पता लगाना। (ए) एमएमसी में एक बूंद का तरंग। यह तरंग एमएमसी स्पेक्ट्रोमीटर के कच्चे वर्णक्रमीय डेटा से आता है। पृष्ठभूमि में कच्चे वर्णक्रमीय डेटा को संसाधित करने के बाद, एमएमसी मापा ओडी मान देगा। (बी) एमएमसी में बूंदों की ओडी गणना। बूंद के तरंग में, 'ए' बूंद की अधिकतम लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है, 'सी' तेल चरण और पानी के चरण द्वारा गठित आर्क के आकार के इंटरफ़ेस का प्रतिनिधित्व करता है, और 'बी' बूंद के मुख्य भाग का प्रतिनिधित्व करता है। लैम्बर्ट-बीयर कानून के आधार पर, बूंद के OD मान की गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके की जाती है: OD मान = lg(E/D) × 10. 'ई' तेल चरण के औसत वर्णक्रमीय संकेत मूल्य को संदर्भित करता है; 'डी' बूंद के मुख्य भाग बी के औसत वर्णक्रमीय संकेत मूल्य को संदर्भित करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एमएमसी द्वारा मापा गया ओडी मान एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापा गया जितना अलग है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: बूंदों के बीच crosstalk का परीक्षण. यह सत्यापित करने के लिए कि क्या दीर्घकालिक खेती के दौरान बूंदों के बीच क्रॉसस्टॉक है, ई कोलाई MG1655 समाधान को बहुत कम एकाग्रता (पॉइसन वितरण के अनुसार, π = 0.1) में पतला किया गया था, और फिर 200 बूंदों को उत्पन्न किया गया था और 5 दिनों के लिए खेती की गई थी। ओडी को मापने के बाद, यह पाया गया कि ई कोलाई एमजी 1655 बूंदों की एक छोटी संख्या में बढ़ गया। और इन बूंदों के आसपास की बूंदों में लगभग कोई जीवाणु वृद्धि नहीं हुई थी। परिणाम यह भी प्राथमिक रूप से दिखाता है कि बूंदों के बीच थोड़ा क्रॉसस्टॉक है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: एमएमसी में बूंद उत्पादन की स्थिरता। जैसा कि अनुपूरक चित्र 1 में दिखाया गया है, बूंद में एक निश्चित तरंग होती है। एमएमसी का स्पेक्ट्रोमीटर प्रति सेकंड एक निश्चित संख्या में डेटा बिंदु उत्पन्न करता है, इसलिए ड्रॉपलेट तरंग के डेटा बिंदुओं की संख्या ड्रॉपलेट के आकार को प्रतिबिंबित कर सकती है। लाल डाई समाधान का उपयोग एमएमसी में 397 बूंदों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था, और ओडी मूल्य को मापा गया था। कच्चे वर्णक्रमीय डेटा को निर्यात किया गया था, प्रत्येक ड्रॉपलेट तरंग के डेटा बिंदुओं की गणना की गई थी, और ड्रॉपलेट डेटा बिंदुओं के भिन्नता के गुणांक (सीवी) की गणना की गई थी। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: एमएमसी में बूंद वाष्पीकरण। यहां लाल डाई समाधान का उपयोग एमएमसी में बूंदों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था और बूंदों को खेती ट्यूब में संग्रहीत किया गया था। ट्यूब को तब 30 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्थिर तापमान इनक्यूबेटर में रखा गया था, और बूंद की लंबाई को नियमित रूप से मापा गया था (माइक्रोस्कोप के नीचे तस्वीरें लें और स्केल बार के साथ लंबाई को मापें)। यह दर्शाता है कि 30 दिनों के बाद बूंद की मात्रा लगभग 12.3% कम हो गई थी, जो इंगित करता है कि एमएमसी में बूंद का वाष्पीकरण बहुत छोटा है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कि स्वचालित माइक्रोबियल खेती और दीर्घकालिक अनुकूली विकास करने के लिए माइक्रोबियल माइक्रोड्रॉपलेट कल्चर सिस्टम (एमएमसी) का उपयोग कैसे किया जाए। एमएमसी एक लघुकृत, स्वचालित, और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबियल खेती प्रणाली है। पारंपरिक माइक्रोबियल उच्च-थ्रूपुट खेती विधियों और उपकरणों की तुलना में, एमएमसी के कई फायदे हैं जैसे कि कम श्रम और अभिकर्मक खपत, सरल संचालन, ऑनलाइन डिटेक्शन (ओडी और प्रतिदीप्ति), उच्च समय-रिज़ॉल्यूशन डेटा संग्रह, और बेहतर समानांतरीकरण। एमएमसी के पास पारंपरिक बूंद माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक से अलग कुछ विशेष फायदे भी हैं, जो आमतौर पर पीएल और एनएल बूंदों का उपयोग करते हैं। पीएल और एनएल बूंदों का उपयोग करने वाले अधिकांश पहले रिपोर्ट किए गए सिस्टम में खराब खेती का प्रदर्शन होता है और कुछ पता लगाने योग्य पैरामीटर (आमतौर पर केवल प्रतिदीप्ति) 18,19,20,21 होते हैं। हालांकि कुछ प्लेटफ़ॉर्म हैं जो बेहतर खेती के प्रदर्शन और कई पैरामीटर का पता लगाने को प्राप्त कर सकते हैं, यह मुश्किल है और इसके लिए बहुत प्रयास की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, कुछ शोधकर्ताओं ने पीएल बूंदों के ओडी का पता लगाने की सूचना दी। यह छवि मान्यता पर आधारित है, जिसमें न केवल झूठी सकारात्मकता है, बल्कि सटीकताके आगे सत्यापन की भी आवश्यकता है। हालांकि, एमएमसी इन्हें अपेक्षाकृत सरल तरीके से पूरा कर सकता है। एमएमसी माइक्रोलीटर (μL) बूंदों का उपयोग करता है जो शायद ही कभी रिपोर्ट किए जाते हैं। एमएमसी के बेहतर माइक्रोबियल खेती प्रदर्शन को सत्यापित किया गया है, और यह सीधे ओडी और प्रतिदीप्ति का भी पता लगा सकता है। μL बूंदों की बड़ी मात्रा के कारण, बूंद पीढ़ी हस्तक्षेप के लिए कम संवेदनशील होती है, जिसमें उच्च स्थिरता होती है। इस बीच, माइक्रोलीटर बूंदों में अधिक विविध संचालन किए जा सकते हैं, जो स्वचालित संचालन की प्राप्ति के लिए अनुकूल हैं। इसके अलावा, क्योंकि बूंदें संलग्नक रिक्त स्थान हैं, सामग्री की अस्थिरता को दबाया जा सकता है (पूरक तालिका 2), दीर्घकालिक माइक्रोबियल खेती और अनुकूली विकास करने के लिए अनुकूल है जब वाष्पशील पदार्थ मध्यम14 में मौजूद होते हैं। शेक फ्लास्क और माइक्रोप्लेट्स में इसे हासिल करना मुश्किल है।

हालांकि, प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण बिंदु जोर देने योग्य हैं। सबसे पहले, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एमएमसी द्वारा मापा गया ओडी मान एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से अलग है क्योंकि ओडी माप की उनकी ऑप्टिकल पथ लंबाई अलग-अलग है (क्रमशः 1 मिमी और 10 मिमी)। इसलिए, शेक फ्लास्क के साथ एमएमसी के ओडी मान की तुलना करते समय, अंशांकन वक्र13 को मापना आवश्यक है। सौभाग्य से, अनुकूली विकास प्रक्रिया को अंशांकन वक्रों की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि हम विकास वक्रों के बीच सापेक्ष रुझानों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इसके बाद, एमएमसी में कुछ सूक्ष्मजीवों को बिना खेती के किया जाता है। बूंदें स्थिरता बनाए रखने के लिए तेल-पानी के इंटरफ़ेस की सतह के तनाव पर भरोसा करतीहैं। यदि सूक्ष्मजीव कुछ पदार्थों का उत्पादन करते हैं जो तेल-पानी के इंटरफ़ेस की सतह के तनाव को बाधित करते हैं, जैसे कि सर्फेक्टेंट24 का उत्पादन करने वाले कुछ बैसिलस सबटिलिस उपभेद, बूंदें स्थिरता बनाए नहीं रख सकती हैं। इसके अलावा, यदि माध्यम स्वयं बूंदों की पीढ़ी के लिए एक बाधा है, तो एमएमसी में उपयोग किया जाना व्यवहार्य नहीं है, उदाहरण के लिए, बहुत चिपचिपा माध्यम या बड़े कणों वाले माध्यम। वर्तमान में, एमएमसी में हमने जिन प्रजातियों की सफलतापूर्वक खेती की है, उनमें ई कोलाई, लैक्टोबैसिलस प्लांटरम, कोरिनेबैक्टीरियम ग्लूटामिकम, खमीर, मेथिलोबैक्टीरियम एक्सटॉर्केन्स, एस्परगिलस ओरिज़ा, माइक्रोएल्गी और इसी तरह शामिल हैं। प्रारंभिक प्रयोग के लिए एमएमसी में तनाव की खेती करने की सिफारिश की जाती है। अंत में, चिप, अभिकर्मक बोतल और एमएमसी के बीच कनेक्टर और पोर्ट को प्रोटोकॉल के अनुसार सख्ती से जोड़ा जाना चाहिए। अन्यथा, बैक्टीरिया समाधान एमएमसी में प्रवाहित हो सकता है और इंटीरियर को दूषित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, यह इंगित किया जाना चाहिए कि एमएमसी का वर्तमान थ्रूपुट सीमित (0-200) है, उप-खेती के संचालन के लिए लगने वाले समय के कारण। भविष्य में, हम नियंत्रण सॉफ्टवेयर और समय को कम करने और थ्रूपुट में सुधार करने के लिए चिप के आकार को अनुकूलित करेंगे। चूंकि एमएमसी एक मॉड्यूलर प्रणाली है, इसलिए केवल संबंधित भागों या सॉफ़्टवेयर को नए उपकरणों की आवश्यकता के बिना प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है।

वर्तमान में, एमएमसी न केवल विकास वक्र माप, अनुकूली प्रयोगशाला विकास, और एकल-कारक बहु-स्तरीय विश्लेषण का संचालन कर सकता है, बल्कि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विभिन्न बूंद संचालन प्रक्रियाओं को अनुकूलित करने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है। भविष्य में, माइक्रोबियल अनुसंधान की विभिन्न जरूरतों के जवाब में एमएमसी सिस्टम के आवेदन कार्यों को और समृद्ध करना आवश्यक है, जैसे कि बहु-कारक बहु-स्तरीय ऑर्थोगोनल प्रयोगों का संचालन, बहु-नमूना स्वचालित नमूना तकनीक एक साथ कई जीवाणु प्रजातियों के विकास वक्रों को मापने के लिए, और सटीक रूप से अधिक मापदंडों (जैसे, भंग ऑक्सीजन (डीओ) और पीएच) का पता लगाने और नियंत्रित करने के लिए। इसी समय, एमएमसी को अधिक व्यावहारिक परिदृश्यों पर लागू करने के लिए माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में अधिक कार्यों को विकसित करना भी आवश्यक है, जैसे कि मध्यम रचनाओं का अनुकूलन, न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) का निर्धारण, सूक्ष्मजीवों की सह-खेती25, आदि।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFA0901500), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21627812) के राष्ट्रीय प्रमुख वैज्ञानिक साधन और उपकरण परियोजना और सिंघुआ विश्वविद्यालय पहल वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यक्रम (20161080108) द्वारा समर्थित किया गया था। हम मेथनॉल-आवश्यक ई कोलाई स्ट्रेन संस्करण 2.2 (MeSV2.2) के प्रावधान के लिए प्रोफेसर जूलिया ए वोरहोल्ट (माइक्रोबायोलॉजी संस्थान, जीव विज्ञान विभाग, ईटीएच ज्यूरिख, ज्यूरिख 8093, स्विट्जरलैंड) को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PVDF filter membrane Merck Millipore Ltd. SLGPR33RB Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator Haier BCD-289BSW For reagent storage
Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For solid plate preparation
CaCl2·2H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20011160 Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. DL-CJ-INDII For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10007216 Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer Lenovo E450 Software installation and MMC control
Constant temperature incubator Shanghai qixin scientific instrument co., LTD LRH 250 For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10008218 Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance OHAUS AR 3130 For reagent weighing
EP tube Thermo Fisher 1.5 mL For droplet collection
FeCl3·6H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10011928 Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube Thermo Fisher 2.0 mL For strain preservation
Gluconate Sigma-Aldrich S2054 Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol GENERAL-REAGENT G66258A For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot SANYO Electric MLS3020 For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) Biotopped 420322 Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate Solarbio K8020 Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4 MACKLIN P815661 Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol MACKLIN M813895 Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O BIOBYING 1305715 Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC) Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-ALE-OD For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-M/S-OD The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 20026118 Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl GENERAL-REAGENT G81793J Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O GENERAL-REAGENT G10267B Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10001518 Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish Corning Incorporated 90 mm For the preparation of solid medium
Pipette eppendorf 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL For liquid handling
Quick connector A Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. — For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-PCB Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask Union-Biotech 50 mL For microbial cultivation
Shaking incubator Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. SKY-210 2B For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate Solarbio S8290 Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD 10 mL Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle OUBEL Hardware Store 22G Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042 Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator SANYO Ultra-low MDF-U4086S For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer General Electric Company Ultrospec 3100 pro For the measurement of OD values
Vitamin B1 Solarbio SV8080 Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021 Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. 10024018 Component of the special medium for MeSV2.2.

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References

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Jian, X., Guo, X., Wang, J., Tan, Z. L., Xing, X. h., Wang, L., Zhang, C. Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC). J. Vis. Exp. (180), e62800, doi:10.3791/62800 (2022).

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