הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.
וירוס פס האורז (RSV), שגורם לאובדן כלכלי משמעותי של החקלאות במזרח אסיה, תלוי לחלוטין בווקטורים של חרקים להעברתו האפקטיבית בקרב אורז מארח. לאודלפקס סטריאטלוס (באנגלית: Laodelphax striatellus) הוא וקטור החרקים העיקרי המעביר אופקית RSV תוך מציצת שרף מהפלום. הרוק ממלא תפקיד משמעותי בהתנהגות ההאכלה של החרקים. שיטה נוחה שתהיה שימושית למחקר על רוק חרקים עם התנהגות האכלה מוצצת פירסינג מתוארת כאן. בשיטה זו, חרקים הורשו לאכול על דיאטה מלאכותית בין שתי שכבות סרט פרפין מתוח. הדיאטה המכילה את הרוק נאספה מדי יום, מסוננת ומרוכזת לניתוח נוסף. לבסוף, איכות הרוק שנאסף נבדקה על ידי כתמי חלבון וחיסון. שיטה זו באה לידית על ידי זיהוי נוכחות של RSV וחלבון דמוי מוצין ברוק של SBPH. שיטת האכלה מלאכותית ואיסוף רוקים אלה תכשיר בסיס למחקר נוסף על גורמים ברוק חרקים הקשורים להתנהגות האכלה ולהעברת וירוסים.
וירוס פסים אורז (RSV), וירוס RNA שלילי תקוע בסוג Tenuivirus, גורם למחלות קשות בייצור אורז במזרח אסיה1,2,3. העברת RSV מצמחי אורז נגועים לבריאים תלויה בווקטורים של חרקים, בעיקר לאודלפקס סטריאטלוס, המעביר RSV באופן מתמשך-מפיץ. SBPH רוכש את הנגיף לאחר האכלה על צמחים נגועים RSV. ברגע שבתוך החרק, RSV מדביק את תא האפיתל midgut יום אחד לאחר האכלה ולאחר מכן עובר דרך מחסום midgut לחדור המולימף. לאחר מכן, RSV מתפשט לתוך רקמות שונות באמצעות ההמולימפה ולאחר מכן מתפשט. לאחר תקופה סמויה של כ 10-14 ימים לאחר הרכישה, הנגיף בתוך בלוטת הרוק יכול להיות מועבר לצמחים המארחים בריאים באמצעות הרוק המופרש בעוד SBPH מוצץ sap מן phloem4,5,6,7,8,9,10 . תהליך האכלה יעיל וגורמים שונים ברוק חיוניים להתפשטות RSV מהחרק לצמח המארח.
רוק חרקים המופרש על ידי בלוטות הרוק הוא האמין לתווך חרקים, וירוסים, צמחים מארחים. חרקים Hemipteran בדרך כלל לייצר שני סוגים של רוק: רוק ג’לינג ורוק מימי11,12,13. רוק גלינג מופרש בעיקר לתוך apoplasm כדי לקיים את התנועה של stylet בין תאים מארחים והוא קשור גם להתגברות על התנגדות הצמח ותגובות חיסוניות14,15,16,17. בשלב החיטוט של האכלה, חרקים מפרישים לסירוגין רוק ג’לינג שמיד מתחמצן ויוצר אוגן על פני השטח. לאחר מכן, נדן יחיד או מסועף עטוף את הסגנון כדי להזמין ערוץ צינורי18,19,20. אוגן פני השטח על האפידרמיס הוא הניח כדי להקל על חדירה של stylet על ידי משמש כנקודת עיגון, בעוד נדן סביב stylet עשוי לספק יציבות מכנית סיכה16,21,22,23. Nlshp זוהה כחלבון חיוני להיווצרות נדן הרוק והאכלה מוצלחת של צמח חום(Nilaparvata lugens,BPH). עיכוב הביטוי של חלבון הנדן המבני (SHP) המופרש על ידי pisum Acyrthosiphon כנימות הפחית את הרבייה שלה על ידי שיבוש האכלה מצינורות מסננת מארח24. יתר על כן, בכמה מינים חרקים, גורמי רוק ג’ל אמורים לעורר תגובות חיסוניות צמח על ידי יצירת מה שנקרא דפוסים מולקולריים הקשורים אוכלי עשב (HAMPs). ב N. lugens, NlMLP, חלבון דמוי מוצין הקשור להיווצרות נדן, גורם להגנות צמחים מפני האכלה, כולל מוות תאים, ביטוי של גנים הקשורים להגנה, ותצהיר callose 25,26. כמו כן, כמה גורמי רוק ג’ל כנימות הוכחו לעורר תגובות הגנה צמחית באמצעות אינטראקציות בין גנים לגן דומה דפוסים מולקולריים הקשוריםפתוגן 12,15,27.
לחקר גורמי הרוק החיוניים להאכלת חרקים ו/או להעברת פתוגן, יש צורך לנתח רוק מופרש. כאן, שיטות האכלה ואיסוף מלאכותיות כדי להשיג כמויות מספיקות של רוק מתוארים לניתוח נוסף. באמצעות מדיום המכיל רק אלמנט תזונתי אחד, חלבוני רוק רבים נאספו ונותחו על ידי כתמי כסף וכתמים מערביים. שיטה זו תהיה מועילה במחקר נוסף על גורמים ברוק כי הם חיוניים להעברת RSV על ידי SBPH.
גידול מוצלח של חרקים על דיאטות מלאכותיות דווח לראשונה בשנת 1962 כאשר מיטלר ואבא תיארו את טכניקת קרום פרפין להחזיק דיאטה מלאכותית29,30. שיטה זו נחקרה בהיבטים רבים של ביולוגיה והתנהגות חרקים, למשל, תוספת תזונתית, האכלת dsRNA, ורכישת וירוסים. בהתבסס על הדרישות של נית?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס ‘2019YFC1200503), על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס ‘32072385), ועל ידי האגודה לקידום חדשנות נוער CAS (2021084).
10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |