Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

Le présent protocole décrit une méthode permettant de recueillir suffisamment de salive auprès d’insectes perçants-suceurs à l’aide d’un milieu artificiel. Il s’agit d’une méthode pratique pour collecter la salive des insectes et étudier la fonction salivaire sur le comportement alimentaire des insectes et la transmission du virus à transmission vectorielle.

Abstract

Le virus de la bande de riz (VRS), qui cause une perte économique importante de l’agriculture en Asie de l’Est, dépend entièrement des insectes vecteurs pour sa transmission efficace entre le riz hôte. Laodelphax striatellus (petite sauterelle brune, SBPH) est le principal insecte vecteur qui transmet horizontalement le VRS tout en aspirant la sève du phloème. La salive joue un rôle important dans le comportement alimentaire des insectes. Une méthode pratique qui sera utile pour la recherche sur la salive des insectes avec un comportement alimentaire perçant-suceur est décrite ici. Dans cette méthode, les insectes ont été autorisés à se nourrir d’un régime artificiel pris en sandwich entre deux couches de film de paraffine étirées. Le régime alimentaire contenant la salive a été recueilli chaque jour, filtré et concentré pour une analyse plus approfondie. Enfin, la qualité de la salive recueillie a été examinée par coloration protéique et immunobuvardage. Cette méthode a été illustrée par la détection de la présence du VRS et d’une protéine semblable à la mucine dans la salive de l’HBS. Ces méthodes d’alimentation artificielle et de collecte de la salive jetteront les bases de recherches supplémentaires sur les facteurs de la salive des insectes liés au comportement alimentaire et à la transmission du virus.

Introduction

Le virus de la bande de riz (VRS), un virus à ARN à brin négatif du genre Tenuivirus,provoque des maladies graves dans la production de riz en Asie del’Est1,2,3. La transmission du VRS des plants de riz infectés aux plants sains dépend des insectes vecteurs, principalement Laodelphax striatellus, qui transmet le VRS de manière persistante. SBPH acquiert le virus après s’être nourri de plantes infectées par le VRS. Une fois à l’intérieur de l’insecte, le VRS infecte la cellule épithéliale de l’intestin moyen un jour après l’alimentation, puis traverse la barrière de l’intestin moyen pour pénétrer dans l’hémolymphe. Par la suite, le VRS se propage dans différents tissus via l’hémolymphe, puis se propage. Après une période de latence d’environ 10 à 14 jours après l’acquisition, le virus à l’intérieur de la glande salivaire peut être transmis aux plantes hôtes saines via la salive sécrétée tandis que SBPH aspire la sève du phloème4,5,6,7,8,9,10 . Un processus d’alimentation efficace et divers facteurs dans la salive sont essentiels pour la propagation du VRS de l’insecte à la plante hôte.

On pense que la salive d’insecte sécrétée par les glandes salivaires sert de médiateur aux insectes, aux virus et aux plantes hôtes. Les insectes hémiptères produisent généralement deux types de salive: la salive gélifiante et la saliveaqueuse 11,12,13. La salive gélifiante est principalement sécrétée dans l’apoplasme pour soutenir le mouvement du stylet entre les cellules hôtes et est également liée au dépassement de la résistance des plantes et des réponses immunitaires14,15,16,17. Au stade de l’alimentation, les insectes sécrètent par intermittence de la salive gélifiante qui s’oxyde immédiatement pour former une bride de surface. Ensuite, des gaines simples ou ramifiées enveloppent le stylet pour réserver un canal tubulaire18,19,20. La bride de surface sur l’épiderme est supposée faciliter la pénétration du stylet en servant de point d’ancrage, tandis que les gaines autour du stylet peuvent assurer la stabilité mécanique et la lubrification16,21,22,23. Nlshp a été identifié comme une protéine essentielle pour la formation de la gaine salivaire et l’alimentation réussie de la sauterelle brune (Nilaparvata lugens, BPH). L’inhibition de l’expression de la protéine de gaine structurelle (SHP) sécrétée par le puceron Acyrthosiphon pisum a réduit sa reproduction en perturbant l’alimentation à partir des tubes du tamis hôte24. De plus, chez certaines espèces d’insectes, les facteurs de salive en gel sont censés déclencher les réponses immunitaires des plantes en formant des modèles moléculaires dits associés aux herbivores (HAMPs). Chez N. lugens,NlMLP, une protéine semblable à la mucine liée à la formation de gaines, induit des défenses végétales contre l’alimentation, y compris la mort cellulaire, l’expression de gènes liés à la défense et le dépôt de callose 25,26. En outre, il a été prouvé que certains facteurs de salive en gel chez les pucerons déclenchent des réponses de défense des plantes via des interactions gène-à-gène similaires aux modèles moléculaires associés aux agents pathogènes12,15,27.

Pour étudier les facteurs salivaires essentiels à l’alimentation des insectes et / ou à la transmission des agents pathogènes, il est nécessaire d’analyser la salive sécrétée. Ici, les méthodes d’alimentation artificielle et de collecte pour obtenir des quantités suffisantes de salive sont décrites pour une analyse plus approfondie. En utilisant un milieu ne contenant qu’un seul élément nutritionnel, de nombreuses protéines salivaires ont été collectées et analysées par coloration à l’argent et western blotting. Cette méthode sera utile dans d’autres recherches sur les facteurs de la salive qui sont essentiels à la transmission du VRS par SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Maintenance sbph

  1. Élever les individus SBPH virulifères et sans VRS dans un incubateur en verre (65 x 200 mm) avec 5-6 plants de riz(Oryza sativa cv. Nipponbare) par chambre en verre dans le laboratoire. Cultivez les plants de riz à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.
    NOTE: Les individus SBPH virulifères et exempts de VRS ont été initialement capturés dans la province du Jiangsu, en Chine.
  2. Détecter le VRS dans l’HBSP par un dosage immuno-enzymatique (dot-ELISA) avec un anticorps polyclonal spécifique du VRS de lapin (voir tableau des matériaux)élevé contre les ribonucléoprotéines (RNP) du VRS.
    REMARQUE: Pour assurer une efficacité élevée de l’infection de la progéniture, les femelles virulifères ont été maintenues séparément et 15% de leur progéniture ont été testées au hasard pour l’infection par le VRS. Les détails de dot-ELISA sont décrits aux étapes 1.3-1.7.
  3. Homogénéiser un seul SBPH dans 20 μL de tampon de revêtement (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Repérez 3 μL de chacun sur une membrane en nylon (voir Tableau des matériaux),puis séchez la membrane à température ambiante (RT).
  4. Incuber la membrane avec 15 mL de tampon bloquant (PBS + 3% de lait écrémé) pendant 30 min à température ambiante.
  5. Incuber la membrane avec des anticorps de lapin primaires dilués contre le VRS (1:10000) dans 15 mL de PBS pendant 1 h à RT et laver la membrane trois fois avec du PBS pendant 5 min d’incubation à chaque fois.
  6. Incuber la membrane avec 1,5 μL d’anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (voir tableau des matériaux)dans 15 mL de PBS et laver trois fois avec du PBS pendant 5 minutes d’incubation à chaque fois.
  7. Développer les immunoblots avec Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (voir Tableau des matériaux)selon les protocoles fournis par le fabricant.

2. Préparation de la chambre d’alimentation et du régime artificiel

  1. Peser 2 g de poudre de saccharose et la dissoudre dans 40 mL de ddH2O pour préparer une solution aqueuse de saccharose à 5% comme régime artificiel.
  2. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm (voir tableau des matériaux)pour éliminer la contamination bactérienne et les impuretés.
  3. Affamer 200 larves de 3èmeà5 ème SBPH pendant 3-5 h avant de les introduire dans la chambre.
    NOTE: 200 SBPH sont préparés pour une chambre; plus de SBPH devrait être préparé pour plusieurs chambres.
  4. Préparer les cylindres de verre comme des chambres d’alimentation (Figure 1A). Couvrir une extrémité ouverte de la chambre avec une membrane de paraffine (voir tableau des matériaux)avant d’introduire les insectes expérimentaux.
    REMARQUE: Chaque cylindre mesure 15,0 cm de long et 2,5 cm de diamètre. Ces cylindres en verre sont fabriqués sur mesure selon les exigences expérimentales.
  5. Transférer les insectes dans un cylindre en verre.
  6. Couvrir l’autre extrémité de la chambre avec une membrane de paraffine étirée (plus précisément, Parafilm M). Ensuite, ajoutez-y 200 μL de régime artificiel. Enfin, recouvrez le liquide d’une autre couche de membrane de paraffine étirée.
    REMARQUE: La membrane de paraffine est étirée pour environ doubler sa surface d’origine.
  7. Couvrez la chambre avec du papier d’aluminium, mais laissez l’extrémité avec l’appareil de régime artificiel exposé à la lumière.

3. Collecte de salive SBPH

  1. Recueillir le régime artificiel de SBPH sans VRS et virulifère séparément à la fin de la période de 24 heures.
  2. Refroidir le cylindre à 4 °C pour immobiliser les insectes.
  3. Découvrez le film extérieur et recueillez le liquide alimentaire artificiel à l’aide d’une pipette stérile dans des tubes stériles de 1,5 mL. Conserver la salive recueillie à -80 °C jusqu’à l’analyse.
    REMARQUE: La salive recueillie peut être conservée à -80 ° C pendant 1 an.
  4. Rincez la membrane interne avec 50 μL de régime artificiel frais trois fois en pipetant doucement, et recueillez le régime de lavage artificiel comme décrit à l’étape 3.3. Placez le nouveau régime artificiel sur la membrane interne et gardez une membrane de paraffine fraîchement étirée sur le dessus.
  5. Répétez les étapes 3.2 et 3.3 pendant 5 jours à 2 semaines.
    REMARQUE: Comptez le taux de survie de l’alimentation artificielle SBPH et assurez-vous d’un supplément suffisant de SBPH frais en fonction du taux de survie.
  6. Filtrer les échantillons prélevés à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm pour éliminer les microbes et autres contaminants.

4. Concentration de la salive recueillie

  1. Transférer les échantillons de salive prélevés dans un filtre centrifuge de 0,5 mL de 10 kD (voir tableau des matériaux)et filer à 5 500 x g à 4 °C pendant 20 min. Recueillir le surnageant et porter le volume final à 100 μL.
  2. Mesurer la concentration de la salive recueillie à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis approprié en suivant les étapes 4.3-4.6.
  3. Allumez le spectrophotomètre et lavez les piédestaux trois fois avec ddH2O.
  4. Sélectionnez les options suivantes à l’écran dans le bon ordre : Protéines | Protéine A280 | Sélectionnez Type | 1 Abs = 1 mg/mL. Ensuite, cochez la case Correction de ligne de base 340 nm.
  5. Chargez 2 μL de solution aqueuse de saccharose à 5% à blanc, appuyez sur Blank en bas de l’écran.
  6. Après avoir établi des normes, chargez 2 μL de la salive collectée pour la mesure. Lisez et enregistrez la concentration en protéines.
    NOTE: 1 mg de protéines salivaires ont finalement été collectés au total au moins.

5. Coloration à l’argent des protéines salivaires

  1. Extraire les protéines des échantillons de salive d’insectes à l’aide d’un tampon de charge de l’échantillon (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de glycérol, 2% de FDS, 0,1% de bleu de bromophénol et 1% de β-mercaptoéthanol). Ensuite, fractionnez-le de 10% SDS-PAGE (voir Tableau des matériaux). Charger la solution sucroseaqueuse à 5% traitée de la même manière qu’un témoin négatif.
  2. Chargez une aliquote de 20 μL de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE à côté d’un marqueur précoloré. Faites fonctionner le gel pendant 15 min à 90 Volt, puis 50 min à 140 Volt.
  3. Fixer le gel dans de l’éthanol à 30 % (vol/vol), de l’acide acétique à 10 % (vol/vol) pendant au moins 30 min après l’électrophorèse.
  4. Rincez le gel deux fois avec de l’éthanol à 20% (vol/vol) et arrosez séparément pendant 10 min à chaque fois.
  5. Sensibilisez le gel dans 0,8 mM de thiosulfate de sodium pendant 1 min, puis rincez deux fois à l’eau pendant 1 min à chaque fois.
  6. Immerger le gel dans du nitrate d’argent de 12 mM pendant au moins 1 h, puis le tremper dans de l’eau désionisée pendant 10 s avant de le transférer dans la solution de développement.
  7. Lorsque le fond du gel devient sombre, immergez le gel dans une solution d’arrêt (acide acétique à 5%) pendant au moins 30 minutes pour arrêter la réaction.
  8. Lavez le gel deux fois avec de l’eau pendant 30 minutes à chaque fois. Développer l’image avec le système de détection (voir tableau des matériaux).

6. Détection des protéines par transfert western

  1. Détecter la protéine semblable à la mucine salivaire du SBPH (LssgMP) et du VRS par transferts occidentaux à l’aide d’anticorps spécifiques, respectivement.
  2. Traiter les échantillons de salive d’insectes après l’étape 5.1.
  3. Charger une aliquote de 20 μL de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 % à côté d’un marqueur précoloré et d’un échantillon de salive non infectée par le VRS de 20 μL comme témoin négatif. Faites fonctionner le gel pendant 15 min à 90 Volt, puis pendant 50 min à 140 Volt.
  4. Mélanger 100 mL de tampon de transfert de protéines 10x (humide) (voir Tableau des matériaux)avec 900 mL de ddH2O dans une solution de travail (1x), puis transférer les protéines dans une membrane de difluorure de polyvinylidène à l’aide d’un tampon de transfert de protéines (1x).
  5. Bloquer la membrane dans du lait écrémé à 5 % avec une solution saline tamponnée Tris de 0,01 M avec une solution saline tween 20 à 0,05 % (TBST) à température ambiante (RT) pendant 1 h.
    REMARQUE: Dans ce protocole, mélanger 100 mL de 10x TBST (voir Tableau des matériaux)avec 900 mL de ddH2O dans la solution de travail.
  6. Incuber la membrane avec des anticorps primaires de lapin contre le VRS ou le LssgMP (tous deux 1:10000) dilués dans tbST à RT pendant au moins 2 h.
    REMARQUE: La production d’anticorps primaires contre le VRS a été mentionnée ci-dessus. Une société de biotechnologie a produit l’anticorps polyclonal anti-LssgMP de lapin contre le peptide LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lavez la membrane trois fois avec TBST pendant 10 minutes d’incubation à chaque fois.
  8. Incuber la membrane avec des anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort dilués dans 1:10000 TBST.
  9. Développez les immunoblots avec le système amélioré de détection de transfert Western Blotting par chimiluminescence.

7. Détection du modèle d’expression LssgMP dans SBPH

  1. Immobiliser les insectes à 4 °C pendant 5 min.
  2. Lavez les insectes avec de l’éthanol à 75 % et du ddH2O un par un, puis disséquez les insectes dans du TBS pré-réfrigéré (solution saline tamponnée Tris de 0,01 M).
  3. Disséquer les insectes de l’abdomen tout en coupant les pattes antérieures de SBPH à l’articulation coxa-trochanter par pince; laver l’intestin moyen et les glandes salivaires deux fois dans le SCT pour éliminer toute contamination de l’hémolymphe.
  4. Mettez cinq tissus dans un tube sans RNase de 1,5 mL pour extraire l’ARN. Considérez chaque tube comme un échantillon.
  5. Effectuer l’extraction de l’ARN selon les protocoles du fabricant et la PCR transcriptionnelle inverse (RT-PCR) (voir Tableau des matériaux).
  6. Effectuer une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) pour étudier les niveaux relatifs d’expression de transcription de LssgMP dans des extraits de tout le corps ou de divers tissus de L. striatellus.
    REMARQUE: Les paires d’amorces utilisées pour l’amplification des gènes étaient LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green-based qPCR a été réalisée selon le protocole du fabricant. Le niveau de transcription du facteur d’allongement de la traduction de L. striatellus 2 (ef2) a été quantifié avec la paire d’amorces ef2-q-F /ef2-q-R pour la normalisation des modèles d’ADNc. Et les séquences d’amorce sont jointesci-dessous: LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Schémas de l’installation d’alimentation artificielle et de la collecte de salive
La figure 1A représente le cylindre de verre (15 cm x 2,5 cm) utilisé comme chambre d’alimentation pour recueillir la salive. Tout d’abord, les larves de SBPH ont été affamées pendant plusieurs heures pour améliorer l’efficacité de la collecte, puis immobilisées en refroidissant pendant 5 minutes. Après le transfert des insectes dans le cylindre de verre, les deux extrémités ouvertes de la chambre ont été recouvertes d’une membrane de paraffine étirée. À une extrémité, 200 μL de saccharose à 5 % ont été pris en sandwich entre deux couches de membrane de paraffine étendue à environ le double de sa surface d’origine(figure 1B). La chambre était recouverte de papier d’aluminium, mais l’extrémité avec le régime artificiel était exposée à la lumière. Parce que SBPH affiche un comportement phototropique, les insectes affamés rassemblés à la fin ont été exposés à la lumière et nourris avec la solution de régime artificiel à travers la membrane interne de paraffine étirée. Sur cette base, la salive pourrait être libérée dans le régime artificiel, qui était collecté chaque jour. L’appareil Parafilm-diet a été remplacé par un nouveau chaque jour. De cette façon, le régime artificiel a été prélevé pendant 5 jours à 2 semaines, puis l’échantillon entier a été concentré à un volume final de 100 μL à l’aide d’un filtre centrifuge de 10 KD(Figure 1C). Lors de la collecte de la salive, le taux de survie de SBPH nourrissant le saccharose à 5% a été compté. Au cours des 4 premiers jours, plus de 80% de SBPH ont survécu. Cependant, à partir du5 e jour, la mortalité a augmenté rapidement jusqu’à 40 %, et moins de la moitié des SBPH ont survécu le 7e jour(Figure 1D). Pour recueillir suffisamment de salive, il a été suggéré de fournir du SBPH frais le4 e jour.

Vérification des protéines salivaires collectées
Pour évaluer l’efficacité de cette méthode de prélèvement, l’échantillon de salive a été soumis à une analyse protéique. Tout d’abord, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, puis détectées par coloration à l’argent(Figure 2A). Par rapport au témoin négatif (5 % de saccharose), les échantillons concentrés de salive de l’HBSP infectée par le VRS contenaient de nombreuses protéines qui pouvaient être analysées plus en détail, par spectrométrie de masse. En tant que principal insecte vecteur du VRS, sbph transmet le virus aux plantes via son processus d’alimentation suceur-perçage. La libération réussie du VRS est liée à la sécrétion de salive, et le VRS est considéré comme un facteur essentiel dans la salive des insectes virulifères. Ici, la salive a été testée après avoir recueilli des insectes non infectés et virulifères avec un anticorps contre le VRS et a détecté avec succès la protéine de pelage du VRS (CP) dans l’échantillon virulifère (Figure 2B). Une autre étude a révélé que les protéines de mucine sont des protéines salivaires de gel essentielles chez les insectes hémiptères pour méditer la formation d’une gaine pour l’alimentation23. Pour confirmer que SBPH produit également une protéine de mucine, tout le cadre de lecture ouvert d’un gène codant pour la mucine putative a été amplifié à partir de l’ARN extrait de la glande salivaire de SBPH. Sa séquence a été utilisée comme requête dans les analyses BLAST contre la séquence du génome de SBPH28. Un gène composé de 2175 bp, nommé LssgMP, a été identifié. Un anticorps contre cette protéine a été préparé précédemment et a été utilisé pour détecter la protéine dans l’échantillon prélevé par analyse par transfert western. Une protéine 78 KD a été détectée dans des échantillons non infectés et virulifères, démontrant que LssgMP est une protéine salivaire (Figure 2C). Ensuite, les niveaux de transcription de LssgMP dans différents tissus (glande salivaire, intestin et corps restant) ont été déterminés par qRT-PCR. Les résultats ont montré que le niveau de transcription du gène était 20 fois plus élevé dans la glande salivaire que dans l’intestin et d’autres parties du corps (Figure 2D), confirmant l’expression spécifique de LssgMP dans la glande salivaire.

Figure 1
Figure 1: Schéma de la chambre d’alimentation avec sandwich à membrane de paraffine pour permettre l’alimentation de SBPH sur un régime artificiel. (A) Illustration de la chambre d’alimentation artificielle. Le cylindre mesure 15,0 cm de long et 2,5 cm de diamètre. À une extrémité de la chambre se trouve le sandwich de membrane de paraffine; l’autre extrémité et la paroi du cylindre recouverte de papier d’aluminium (lignes inclinées) représentent l’appareil recouvert de papier d’aluminium. La source de lumière a été réglée pour attirer SBPH pour se nourrir du régime artificiel. (B) Schéma du sandwich à la paraffine contenant un régime artificiel. 200 μL de solution aqueuse de saccharose à 5 % ont été pris en sandwich entre deux couches de membranes de paraffine étirées pour environ le double de leur surface d’origine. (C) Concentration de salive collectée à l’aide d’un filtre centrifuge de 10 KD. (D) Taux de survie de l’ALIMENTATIONSS À 5 % de saccharose. La moyenne et le SEM ont été calculés à partir de quatre réplicats biologiques avec trois réplicats techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Vérification des protéines salivaires collectées. (A) Détection des protéines salivaires par coloration à l’argent. Le saccharose à 5% est un contrôle négatif. (B) Détection de la protéine de pelage du virus de la bande de riz (CP) dans la salive recueillie par analyse par transfert de Western. (C) Western blotting pour confirmer la présence de LssgMP dans la salive collectée. (D) Expression spécifique de LssgMP dans la glande salivaire de L. striatellus. ef2: facteur d’allongement de traduction 2 de SBPH. La moyenne et le SEM ont été calculés à partir de quatre réplicats biologiques avec trois réplicats techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L’élevage réussi d’insectes sur des régimes artificiels a été signalé pour la première fois en 1962 lorsque Mittler et Dadd ont décrit la technique de la membrane de paraffine pour tenir un régime artificiel29,30. Et cette méthode a été explorée dans de nombreux aspects de la biologie et du comportement des insectes, par exemple, le supplément nutritif, l’alimentation en ARNd et l’acquisition de virus. Sur la base des exigences de l’analyse de la salive, 5% de saccharose est utilisé comme régime artificiel général pour recueillir la salive de SBPH dans cette étude. Pour une collecte de salive réussie, plusieurs étapes critiques méritent d’être notées ici. Tout d’abord, affamer les insectes expérimentaux avant de les introduire dans la chambre est nécessaire pour assurer l’efficacité de la collecte de la salive. Deuxièmement, pour imiter l’environnement stylet, un sandwich à la paraffine à deux couches est fabriqué. Lorsque SBPH se nourrit du régime artificiel, la gaine salivaire se forme à l’extrémité intérieure face au régime et la salive aqueuse est sécrétée par la suite. Troisièmement, un milieu artificiel doit être prélevé et échangé à temps pour réduire la contamination microbienne dans l’échantillon prélevé. Enfin, anesthésier les insectes à 4 °C pendant 5 min est essentiel pour éviter la perte d’insectes tout en changeant le régime alimentaire artificiel.

Contrairement à la plupart des régimes artificiels qui contiennent des acides aminés, des vitamines et des glucides, les avantages du milieu saccharose à 5% sont remarquables. Tout d’abord, il est facile à préparer. Deuxièmement, la composition simple du régime alimentaire signifie peu de substances pour interférer avec une analyse plus approfondie des différents facteurs de la salive. Néanmoins, le taux de survie de l’HPSS a diminué dans les derniers jours de la période d’alimentation en utilisant 5% de saccharose comme régime artificiel général (Figure 1D). Pour surmonter ce défaut, le SBPH frais doit être fourni à temps pour suffisamment de salive. Et pour d’autres recherches sur la fonction salivaire sur le comportement alimentaire ou la transmission du virus, la durée de la collecte de la salive devrait être limitée au temps précis avant que la mortalité des insectes n’augmente en raison de l’innutrition. Cela semble être une limitation commune du milieu artificiel. D’autres études ont révélé que la survie de N. lugens élevés selon le régime chimiquement défini D-97 était inférieure à celle de ceux élevés sur la variété de riz sensible TN1, ce qui implique que l’hôte d’origine fournit plus que de simples insectes vecteurs alimentaires. Et plusieurs études se sont concentrées sur l’optimisation des régimes chimiquement définis pour l’alimentation continue des insectes afin d’améliorer l’efficacité de l’élevage.

L’analyse du transcriptome de la glande salivaire est une méthode traditionnelle d’identification des protéines salivaires. Et différentes protéines salivaires ont été détectées chez les mêmes espèces d’A. pisum et de M. persicae14,31, et l’abondance de protéines salivaires détermine la fréquence de leur détection32. Cependant, une méthode valide pour étudier la protéine suspectée dans la salive manquait. Cette méthode sandwich à membrane de paraffine fournit un moyen innovant de confirmer une protéine salivaire suspectée identifiée par l’analyse du transcriptome, ce qui est encore prouvé par la détection de LssgMP (Figure 2C). De plus, l’analyse des protéines a confirmé que des protéines abondantes sont présentes dans la salive collectée(Figure 2A),ce qui est une quantité suffisante pour une analyse plus approfondie, par exemple par spectrométrie de masse. L’analyse protéomique de la salive recueillie sera une méthode directe et efficace pour identifier les facteurs sécrétés impliqués dans la phase d’alimentation de SBPH, minimisant ainsi le risque de détecter des protéines redondantes faussement positives.

La salive agit comme vecteur du virus de l’insecte aux plantes hôtes et est un composant essentiel de l’interaction vecteur-virus-plante14,33,34. Le titre de virus libéré par les insectes vecteurs est un facteur crucial pour l’infection de l’hôte. Comparé aux méthodes indirectes qui testent le titre viral chez les plantes infectées, ce protocole peut détecter directement le VRS libéré par l’HPSS virulière (Figure 2B). Soutenues par cette méthode sandwich à membrane de paraffine, d’autres analyses comparatives des protéines salivaires recueillies auprès d’insectes exempts de VRS et infectés par le VRS pourraient également révéler des candidats potentiels impliqués dans l’interaction virus-plante-vecteur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program of China (n° 2019YFC1200503), par la National Science Foundation of China (n° 32072385) et par la Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

Biologie numéro 174
Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive <em>Laodelphax striatellus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter