Tolags membransmørbrødmetode for Laodelphax striatellus spyttsamling
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å samle tilstrekkelig spytt fra piercing-sugende insekter ved hjelp av et kunstig medium. Dette er en praktisk metode for å samle insektsspytt og studere spyttfunksjon på insektfôringsadferd og vektorbåren virusoverføring.
Abstract
Ris stripe virus (RSV), som forårsaker betydelig økonomisk tap av landbruk i Øst-Asia, helt avhenger av insektvektorer for sin effektive overføring blant vertsris. Laodelphax striatellus (liten brun plantehopper, SBPH) er den primære insektvektoren som horisontalt overfører RSV mens du suger sap fra phloem. Spytt spiller en betydelig rolle i insekters fôringsadferd. En praktisk metode som vil være nyttig for forskning på insekter spytt med piercing-sugende fôringsadferd er beskrevet her. I denne metoden fikk insekter lov til å mate på et kunstig kosthold smurt mellom to strakte parafinfilmlag. Kostholdet som inneholder spytt ble samlet hver dag, filtrert og konsentrert for videre analyse. Til slutt ble kvaliteten på samlet spytt undersøkt av proteinfarging og immunoblotting. Denne metoden ble eksemplifisert ved å oppdage tilstedeværelsen av RSV og et mucinlignende protein i spytt av SBPH. Disse kunstige fôrings- og spyttinnsamlingsmetodene vil legge grunnlag for videre forskning på faktorer i insektsspytt relatert til fôringsadferd og virusoverføring.
Introduction
Ris stripe virus (RSV), et negativt strandet RNA-virus i slekten Tenuivirus, forårsaker alvorlige sykdommer i risproduksjon i Øst-Asia1,2,3. Overføring av RSV fra infiserte risplanter til friske avhenger av insektvektorer, hovedsakelig Laodelphax striatellus, som overfører RSV på en vedvarende-forplantning. SBPH kjøper viruset etter fôring på RSV-infiserte planter. En gang inne i insektet infiserer RSV midgut epitelcellen en dag etter fôring og passerer deretter gjennom midgutbarrieren for å trenge inn i hemolymfen. Deretter sprer RSV seg inn i forskjellige vev via hemolymfen og forplanter seg deretter. Etter en latent periode på ca 10-14 dager etter oppkjøpet, kan viruset inne i spyttkjertelen overføres til de sunne vertsplantene via utskilt spytt mens SBPH suger sap fra phloem4,5,6,7,8,9,10 . En effektiv fôringsprosess og ulike faktorer i spytt er avgjørende for spredning av RSV fra insektet til vertsanlegget.
Insekt spytt utskilt av spyttkjertler antas å megle insekter, virus og vertsplanter. Hemipteran insekter produserer vanligvis to typer spytt: gelling spytt og vannaktig spytt11,12,13. Gelling spytt utskilles hovedsakelig i apoplasma for å opprettholde bevegelsen av stylet blant vertsceller og er også relatert til å overvinne plantemotstand og immunresponser14,15,16,17. På undersøkelsesstadiet av fôring utskiller insekter periodisk gelling spytt som umiddelbart blir oksidert for å danne en overflateflens. Deretter omslutter enkle eller forgrenede kapper stileten for å reservere en rørformet kanal18,19,20. Overflateflensen på epidermis antas å lette penetrasjon av stylet ved å tjene som et ankerpunkt, mens kappene rundt stilekten kan gi mekanisk stabilitet og smøring16,21,22,23. Nlshp ble identifisert som et essensielt protein for spytthylsedannelse og vellykket fôring av brun plantehopper (Nilaparvata lugens, BPH). Hemming av uttrykket av strukturelt kappeprotein (SHP) utskilt av bladlusen Acyrthosiphon pisum reduserte reproduksjonen ved å forstyrre fôring fra vertssikterør24. Videre, i noen insektarter, gel spytt faktorer er ment å utløse plante immunresponser ved å danne såkalte plantelevende-assosierte molekylære mønstre (HAMPs). I N. lugens, NlMLP, et mucinlignende protein relatert til kappedannelse, induserer planteforsvar mot fôring, inkludert celledød, uttrykk for forsvarsrelaterte gener og calloseavsetning 25,26. Også noen gel spyttfaktorer i bladlus har vist seg å utløse planteforsvarsresponser via gen-til-gen interaksjoner som ligner patogen-tilknyttede molekylære mønstre12,15,27.
For å studere spyttfaktorene som er avgjørende for insektfôring og / eller patogenoverføring, er det nødvendig å analysere utskilt spytt. Her beskrives kunstig fôring og innsamlingsmetoder for å oppnå tilstrekkelige mengder spytt for videre analyse. Ved hjelp av et medium som bare inneholder et enkelt ernæringselement, ble mange spyttproteiner samlet og analysert av sølvfarging og vestlig blotting. Denne metoden vil være nyttig i videre forskning på faktorer i spytt som er avgjørende for RSV overføring av SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vellykket oppdrett av insekter på kunstige dietter ble først rapportert i 1962 da Mittler og Dadd beskrev Paraffinmembranteknikken for å holde et kunstig kosthold29,30. Og denne metoden har blitt utforsket i mange aspekter av insektbiologi og oppførsel, for eksempel næringstilskudd, dsRNA-fôring og virusanskaffelse. Basert på kravene til spyttanalyse brukes 5% sukrose som det generelle kunstige kostholdet for å samle spytt av SBPH i denne studien. For vel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program of China (no. 2019YFC1200503), av National Science Foundation of China (No. 32072385), og av Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
