Membransmörgåsmetod i två lager för Laodelphax striatellus salivsamling
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att samla tillräckligt med saliv från piercing-sugande insekter med hjälp av ett artificiellt medium. Detta är en bekväm metod för att samla insektssaliv och studera salivfunktion på insektsmatningsbeteende och vektorburen virusöverföring.
Abstract
Ris randvirus (RSV), som orsakar betydande ekonomisk förlust av jordbruket i Östasien, beror helt på insektsvektorer för dess effektiva överföring bland värdris. Laodelphax striatellus (liten brun växthoppa, SBPH) är den primära insektsvektorn som horisontellt överför RSV medan du suger sap från phloem. Saliv spelar en viktig roll i insekternas utfodringsbeteende. En bekväm metod som kommer att vara användbar för forskning om insekters saliv med piercingsugande utfodringsbeteende beskrivs här. I denna metod tilläts insekter att mata på en konstgjord diet inklämd mellan två sträckta paraffinfilmlager. Dieten som innehåller saliven samlades in varje dag, filtrerades och koncentrerades för vidare analys. Slutligen undersöktes kvaliteten på insamlade saliv genom proteinfärgning och immunoblotting. Denna metod exemplifierades genom att upptäcka förekomsten av RSV och ett mucin-liknande protein i saliv av SBPH. Dessa konstgjorda utfodrings- och salivsamlingsmetod kommer att lägga en grund för ytterligare forskning om faktorer i insektssaliv relaterade till utfodringsbeteende och virusöverföring.
Introduction
Ris randvirus (RSV), ett negativt strandat RNA-virus i släktet Tenuivirus, orsakar allvarliga sjukdomar i risproduktionen i Östasien1,2,3. Överföring av RSV från infekterade risväxter till friska beror på insektsvektorer, främst Laodelphax striatellus, som överför RSV på ett ihållande förökningssätt. SBPH förvärvar viruset efter utfodring på RSV-infekterade växter. En gång inuti insekten infekterar RSV midgut epitelcellen en dag efter utfodring och passerar sedan genom midgutbarriären för att tränga in i hemolymfen. Därefter sprider sig RSV till olika vävnader via hemolymfen och sprider sig sedan. Efter en latent period på ca 10-14 dagar efter förvärvet kan viruset inuti salivkörteln överföras till de friska värdplantorna via det utsöndrade salivet medan SBPH suger sap från phloem4,5,6,7,8,9,10 . En effektiv utfodringsprocess och olika faktorer i saliven är viktiga för spridningen av RSV från insekten till värdväxten.
Insektssaliv som utsöndras av salivkörtlar tros förmedla insekter, virus och värdväxter. Hemipteran insekter producerar vanligtvis två typer av saliv: gelling saliv och vattnigt saliv11,12,13. Gelling saliv utsöndras huvudsakligen i apoplasman för att upprätthålla rörelsen av stylet bland värdceller och är också relaterad till att övervinna växtresistens och immunsvar14,15,16,17. Vid sonderingsstadiet av utfodring utsöndrar insekter periodvis gelling saliv som omedelbart oxideras för att bilda en ytfläns. Sedan omsluter enstaka eller grenade mantlar stylet för att reservera en rörformad kanal18,19,20. Ytflänsen på epidermis antas underlätta inträngning av stylet genom att fungera som en ankarpunkt, medan mantlar runt stylet kan ge mekanisk stabilitet och smörjning16,21,22,23. Nlshp identifierades som ett viktigt protein för salivary mantlade bildandet och framgångsrik utfodring av brun växthopper (Nilaparvata lugens, BPH). Hämning av uttrycket av det strukturella mantlade proteinet (SHP) som utsöndras av bladlusen Acyrthosiphon pisum minskade dess reproduktion genom att störa utfodring från värdsiktsrör24. Dessutom, i vissa insektsarter, gel salivfaktorer är tänkt att utlösa växten immunsvar genom att bilda så kallade växtätare-associerade molekylära mönster (HAMPs). I N. lugensinducerar NlMLP, ett mucinliknande protein relaterat till mantelbildning, växtförsvar mot utfodring, inklusive celldöd, uttryck för försvarsrelaterade gener och callose deposition 25,26. Vissa gel salivfaktorer i bladlöss har också visat sig utlösa växtförsvarssvar via gen-till-geninteraktioner som liknar patogenassocierade molekylära mönster12,15,27.
För att studera salivfaktorerna som är väsentliga för insektsmatning och / eller patogenöverföring är det nödvändigt att analysera utsöndrat saliv. Här beskrivs artificiella utfodrings- och insamlingsmetoder för att få tillräckliga mängder saliv för vidare analys. Med hjälp av ett medium som endast innehåller ett enda näringsämne samlades många salivproteiner in och analyserades av silverfärgning och västerländsk blotting. Denna metod kommer att vara till hjälp i ytterligare forskning om faktorer i saliv som är väsentliga för RSV överföring av SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framgångsrik uppfödning av insekter på konstgjorda dieter rapporterades först 1962 när Mittler och Dadd beskrev Paraffin-membrantekniken för att hålla en konstgjord diet29,30. Och denna metod har utforskats i många aspekter av insektsbiologi och beteende, till exempel näringstillskott, dsRNA-utfodring och virusförvärv. Baserat på kraven för salivanalys används 5% sackaros som den allmänna konstgjorda kosten för att samla saliv av SBPH i denna stud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (nr 2019YFC1200503), av National Science Foundation of China (nr 32072385) och av Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
