该协议详细介绍了从全血,黄褐色涂层或白细胞分离膜中性粒细胞的方法,从而实现良好的产量,高纯度和最小的细胞活化。我们利用梯度纯化,红细胞(RBC)沉降和红细胞裂解来获得高质量/纯度的中性粒细胞制剂。
中性粒细胞(PMN)是人体循环中最丰富的白细胞,占血液白细胞总量的40%至70%。它们是通过血管快速外渗在炎症部位招募的第一批细胞。在那里,嗜中性粒细胞执行一系列功能,以杀死入侵的病原体并介导免疫信号传导。从人体血液中新鲜纯化的中性粒细胞是研究的首选模型,因为没有细胞系完全复制PMN功能和生物学。然而,嗜中性粒细胞是短寿命的末端分化细胞,并且非常容易受到物理(温度,离心速度)和生物(内毒素,化学和细胞因子)刺激的激活。因此,遵循标准化,可靠和快速的方法获得纯和非活化的细胞至关重要。该方案提出了一种更新的方案,结合了密度梯度离心,红细胞(RBC)沉降和红细胞裂解,以获得高PMN纯度并最大限度地减少细胞活化。此外,还讨论了评估中性粒细胞分离质量、活力和纯度的方法。
先天免疫系统由许多细胞类型组成,这些细胞类型维持免疫稳态和病原体清除以及许多其他生理功能。中性粒细胞是人体循环中最大的白细胞库1。大多数成熟的嗜中性粒细胞储存在骨髓中,骨髓是新中性粒细胞的产生部位,也称为造粒。在骨髓中,粒细胞祖细胞退出细胞周期并终末分化,获得其特征性的分段细胞核和颗粒2。在炎症条件下,作为对趋化因子、细胞因子以及损伤相关和病原体相关分子模式的反应,嗜中性粒细胞从血液中和骨髓中动员出来以执行多种功能。这些包括细胞因子分泌,病原体的直接吞噬作用,活性氧的释放,抗菌蛋白的脱颗粒以及中性粒细胞细胞外陷阱的形成。
嗜中性粒细胞用来对抗感染的分子对微生物和宿主有毒。因此,寿命和老化/垂死嗜中性粒细胞的适当去除受到高度调节,并且它们在循环中的寿命有限(<48小时)3。由于这种短暂的生存期,人体平均每天产生1000亿个新的嗜中性粒细胞来维持人口稳态4。紧急造粒术可以进一步增加炎症和感染期间血液中嗜中性粒细胞的释放,包括成熟和未成熟5。中性粒细胞在先天免疫反应中的重要性由获得性或先天性中性粒细胞减少症患者强调,他们容易受到细菌和真菌感染6。
在研究中性粒细胞生物学及其在免疫反应中的作用时,由于其性质,包括其生存期短和细胞毒性含量,会出现许多挑战。中性粒细胞样细胞系通常与人早幼粒细胞白血病HL-60细胞和PLB-985细胞7、8区分开来。虽然它们可以显示中性粒细胞样形态并执行趋化性,但这些细胞系不能完全概括中性粒细胞的生物学。使用这些细胞系的体外测定也无法概括体内实验。此外,这些细胞的分化需要诱导,并且在分化之前可能会受到基因操作的不利影响。
最近,已经开发出通过使用诱导启动子来调节HL-60细胞中基因表达后分化来规避这些问题的方法9。即使使用此类工具,也需要使用药物学方法验证目标的主要人类PMN。因此,必须获得从血液中分离出的纯中性粒细胞和灭活的嗜中性粒细胞,以验证细胞系和动物模型的发现。本文提出了一种修订后的PMN隔离协议,其中评估了当前方法的优缺点10。设计了一种组合,包括梯度离心以将PMN与其他免疫细胞分离,短葡聚糖基沉降以除去大部分红细胞,通过渗透压快速残留红细胞裂解,以及低速离心以除去血小板污染。
由于中性粒细胞的寿命短,末端分化状态和溶解含量,研究这些细胞一直是一个挑战。除了利用小鼠模型或来自患者队列的细胞外,细胞系是帮助研究嗜中性粒细胞生物学的有用工具16。然而,中性粒细胞样细胞系不能完全重申中性粒细胞生物学的所有方面,这为研究这些细胞增加了额外的困难。最常用的体外模型是HL-60细胞系,可以通过用二甲基亚砜或视黄酸17,18处理来分化成中性粒细胞样细胞。虽然这些细胞在研究迁移和呼吸爆发方面很有用,但它们不适合研究嗜中性粒细胞的杀菌活性。存在其他细胞系(PLB-98,NB4),它们也与其限制集19相关。
用小鼠疾病模型和细胞系进行的原发性人类嗜中性粒细胞观察来验证至关重要。中性粒细胞不能有效地冷冻保存,因此通常从从供体获得的全血或浅黄色外套中新鲜分离出来并立即处理。一旦分离,细胞开始经历一种复杂的自发死亡形式,由氧化,细胞质半胱天冬酶和中性粒细胞颗粒中发现的蛋白酶20,21调节。不正确的分离方法或技术可导致嗜中性粒细胞的活化,只会加速细胞死亡。必须有一种可靠和一致的方法,从供体获得纯净和高质量的嗜中性粒细胞。
已经发表了许多关于人类中性粒细胞分离的方法10,22。它们主要分为两类,有一些共同的战略。第一类是基于抗体的,通过阳性或阴性选择。阳性选择将直接标记嗜中性粒细胞,因此提供高纯度的细胞群,尽管它也会导致快速细胞活化,细胞死亡以及嗜中性粒细胞23的不需要标记。阴性选择,尽管使细胞未标记并给出非常纯净的群体,但加速了中性粒细胞死亡,尽管确切的机制尚不清楚(图5)。基因或蛋白质表达在阳性或阴性选择后是否也改变需要进一步研究。此外,由于消耗其他类型的细胞所需的抗体量,这些方法不能输出大量的嗜中性粒细胞。然而,基于抗体的测定仍然可以用于短期培养和较小规模的实验,并且是需要非常高细胞纯度的实验的首选方法,例如基因和蛋白质表达研究。
第二种类型的隔离方法是基于梯度和密度的。它通常涉及Percoll,Ficoll-Paque或其他多糖/聚乙烯吡咯烷酮组分,并利用离心力根据细胞密度分离不同类型的血细胞。这些方法通常与葡聚糖沉淀红细胞相辅相成。这些方法可以处理更大规模的起始材料,也可以实现高纯度。基于密度的分离的一个警告是将其他远不那么丰富的粒细胞(主要是嗜酸性粒细胞)与嗜中性粒细胞分离效率低下,因此,这是所提出的方案的主要局限性,因为即使存在小细胞污染也会影响中性粒细胞反应24。
这里介绍的是一种基于梯度隔离的总结方法,对先前的方法10、22进行细化。我们利用目前对中性粒细胞特异性的低估来可靠地分离具有有限残留血小板和红细胞的纯人嗜中性粒细胞,从而防止中性粒细胞活化和加速死亡。最关键的步骤是梯度的分层,通过在血液下方添加密度梯度介质以获得尖锐的界面,可以更有效地获得梯度。快速检查PBMC环和离心后的梯度可以揭示可能的污染,活化和低产量。当使用白细胞分离膜或白蛋白涂层时,稀释血液很重要,因为过多的细胞密度会导致细胞聚集,导致杂质和细胞活化。
该方案应在2小时内完成以确保细胞新鲜度,并且涉及密度梯度培养基,葡聚糖和裂解的步骤应立即完成,因为暴露于这些溶液可以改变嗜中性粒细胞。使用该协议,嗜中性粒细胞的预期产率至少为约1000万/ 10mL全血和至少约6000万/ 10 mL的黄褐色外套。分离质量的评估应如下:活化的中性粒细胞应小于10%,淋巴细胞污染应低于5%,嗜酸性粒细胞最小(同侧散射但前向散射群体较低),细胞活力应大于90%。较低的纯度可能是由于密度梯度培养基的分层或储存不当或由于起始血液产品的质量和新鲜度造成的。
The authors have nothing to disclose.
该项目由P01HL095489支持。A.Y.H 由 T32HL066987 支持。
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
CD41-APC | biolegend | 303710 | |
Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
Dextran | Fisher | BP1580 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium chloride | sigma | 71376 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |