Summary
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل العدلات من الدم كله، والمعاطف بافي، أو أغشية leukapheresis، وتحقيق عائد جيد، والنقاء العالي، والحد الأدنى من تنشيط الخلية. نحن نستخدم تنقية التدرج، وترسب خلايا الدم الحمراء (RBC)، وتحلل RBC للحصول على إعداد العدلات عالية الجودة / النقاء.
Abstract
العدلات (PMNs) هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدورة الدموية البشرية، وتتراوح بين 40 إلى 70٪ من مجموع الكريات البيض في الدم. وهي أول خلايا يتم تجنيدها في موقع الالتهاب عن طريق البذخ السريع من خلال الأوعية. هناك، العدلات أداء مجموعة من الوظائف لقتل مسببات الأمراض الغازية والتوسط الإشارات المناعية. العدلات النقية حديثا من دم الإنسان هي النموذج المفضل للدراسة، حيث لا يوجد خط خلايا يكرر تماما وظائف PMN والبيولوجيا. ومع ذلك، فإن العدلات هي خلايا قصيرة الأجل ومتمايزة بشكل نهائي وهي عرضة للغاية للتنشيط استجابة للمحفزات الفيزيائية (درجة الحرارة وسرعة الطرد المركزي) والبيولوجية (الإندوتوجين والكيميائي والسيتوكينات). لذلك، من المهم اتباع طريقة موحدة وموثوقة وسريعة للحصول على خلايا نقية وغير نشطة. يقدم هذا البروتوكول بروتوكولا محدثا يجمع بين الطرد المركزي المتدرجة الكثافة، وترسب خلايا الدم الحمراء (RBC)، وتحلل RBC للحصول على نقاء PMN عالي وتقليل تنشيط الخلية. وعلاوة على ذلك، يتم أيضا مناقشة طرق لتقييم جودة عزل العدلات، وقابلية البقاء، والنقاء.
Introduction
يتكون الجهاز المناعي الفطري من العديد من أنواع الخلايا التي تحافظ على التوازن المناعي وإزالة مسببات الأمراض جنبا إلى جنب مع العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى. العدلات تضم أكبر تجمع من خلايا الدم البيضاء في الدورة الدمويةالبشرية 1. يتم تخزين معظم العدلات الناضجة في نخاع العظام ، وهو موقع توليد العدلات الجديدة ، وتسمى أيضا الحبيبية. في نخاع العظام، تخرج السلف الحبيبية من دورة الخلية وتفرق بشكل نهائي، وتكتسب نواتها المقسمة المميزة وحبيباتها2. في ظل الظروف الالتهابية ، استجابة للكيموكينات والسيتوكينات والأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر والمسببات للأمراض ، يتم تعبئة العدلات من مجرى الدم والخروج من نخاع العظام لأداء مجموعة واسعة من الوظائف. وتشمل هذه إفراز السيتوكين، وداء البلعوم المباشر للمسببات المرضية، وإطلاق أنواع الأكسجين التفاعلية، وإزالة البروتينات المضادة للميكروبات، وتشكيل الفخاخ خارج الخلية العدلية.
الجزيئات المستخدمة من قبل العدلات لمكافحة العدوى سامة للميكروبات والمضيف. وهكذا، فإن العمر الافتراضي والإزالة السليمة للشيخوخة / الموت العدلات هي منظمة للغاية، ولها فترة حياة محدودة في الدورة الدموية (<48 ح)3. بسبب هذا البقاء على قيد الحياة قصيرة، ينتج جسم الإنسان في المتوسط 100 مليار العدلات الجديدة كل يوم للحفاظ على التوازن السكاني4. يمكن أن يزيد الورم الحبيبي الطارئ من إطلاق العدلات ، الناضجة وغير الناضجة على حد سواء ، في الدم أثناء الالتهاب والعدوى5. يتم تسليط الضوء على أهمية العدلات في الاستجابة المناعية الفطرية من قبل المرضى الذين يعانون من قلة العدلات المكتسبة أو الخلقية ، الذين هم عرضة للالتهابات البكتيرية والفطرية6.
تنشأ العديد من التحديات عند دراسة بيولوجيا العدلات وأدوارها في الاستجابة المناعية بسبب طبيعتها ، بما في ذلك بقاءها القصير ومحتواها السام للخلايا. وقد تم تمييز خطوط الخلايا الشبيهة بالنيوتروفيل عادة عن سرطان الدم البروميلوسي البشري HL-60 الخلايا وخلايا PLB-9857،8. على الرغم من أنها يمكن أن تعرض مورفولوجيا تشبه العدلات وأداء chemotaxis، هذه الخطوط الخلية لا يمكن تلخيصها تماما بيولوجيا العدلات. كما أن المقايسات المختبرية التي تستخدم خطوط الخلايا هذه غير قادرة على تلخيص تجارب الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن تمايز هذه الخلايا يحتاج إلى تحريض ويمكن أن يتأثر سلبا بالتلاعب الجيني قبل التمايز.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أساليب للتحايل على هذه القضايا باستخدام المروجين غير قابلة للاختزال لتعديل التعبير الجيني بعد التمايز في خلايا HL-609. وحتى مع هذه الأدوات، يطلب من النازات الأولية للرعاية الصحية البشرية التحقق من صحة الأهداف باستخدام النهج الدوائية. وبالتالي، فمن الضروري الحصول على العدلات نقية ومعطلة معزولة عن الدم للتحقق من صحة النتائج التي توصلت إليها خط الخلية والنماذج الحيوانية. تقدم هذه الورقة بروتوكول عزل PMN منقح تم فيه تقييم إيجابيات وسلبيات الأساليب الحالية10. وقد ابتكر مزيج يتألف من الطرد المركزي المتدرجة لفصل PMNs من الخلايا المناعية الأخرى، والترسب قصيرة القائمة على dextran لإزالة الجزء الأكبر من RBCs، وتحلل RBC المتبقية السريعة عن طريق الضغط التناضحي، والطرد المركزي منخفض السرعة لإزالة تلوث الصفائح الدموية.
Protocol
ملاحظة: تم عزل العدلات البشرية من الدم الوريدي من مرشحات خلايا الدم البيضاء المهملة التي تم الحصول عليها من مختبر بنك الدم في مستشفى بوسطن للأطفال. ولم يكن من الممكن التعرف على المتبرعين بالدم، ولم يكن هناك أي تفاعل مع أفراد أحياء أو معرفة بمعلومات شخصية يمكن التعرف عليها. لذلك، لا يصنف هذا العمل كبحث عن مواضيع بشرية بموجب لوائح المواد البشرية HHS (45 CFR الجزء 46). وافق مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى بوسطن للأطفال (IRB) على البروتوكول.
1. طبقات التدرج
- بعد تعقيم معطف برتقالي أو تغليف الدم كله وغطاء غطاء محرك السيارة، وتقسيم الدم إلى أنابيب 50 مل مع 10 مل من الدم في كل أنبوب.
- رفع مستوى الصوت يصل إلى 35 مل مع 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) / هانك متوازن محلول الملح (HBSS) لتمييع الدم لتدرج أنظف.
ملاحظة: عند استخدام غشاء leukapheresis، يمكن مسح الخلايا باستخدام حقنة 60 مل و 30 مل من 5٪ FBS/ HBSS لكل فلتر. التخفيف غير ضروري عند العمل مع الدم الكامل المسحوب حديثا. - أغلق غطاء أنبوب 50 مل، واخلطه عدة مرات عن طريق الانعكاس، وأبقه رأسا على عقب ليكون القاع خاليا من RBCs.
- أضف 10 مل من متوسط تدرج الكثافة (انظر جدول المواد)مباشرة تحت الدم. تأكد من أن الوسط والدم لا يختلطان وأن الواجهة حادة(الشكل 1A).
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة. تأكد من أن محلول تدرج الكثافة في درجة حرارة الغرفة (RT) ومختلط جيدا قبل كل تدرج. أول ملليلتر من متوسط الانحدار الكثافة يحتاج إلى أن تكون بعناية وثبات الطبقات ببطء قدر الإمكان. بعد تعيين سرعة ماصة الإلكترونية إلى منخفضة ينصح. - ضع الأنبوب برفق في جهاز طرد مركزي دون إزعاج التدرج والدوران عند 400 × غرام لمدة 30 دقيقة في RT، مع التأكد من تعطيل الفرامل. لاحظ كيف يفصل التدرج نسج في أعلى المصل / طبقة البلازما، حلقة بيضاء متوسطة من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية (PBMCs)، وطبقة متوسطة التدرج كثافة غائمة، والكريهة السفلي تتكون من الأبيض، والفرقة العدلات رقيقة على رأس RBCs(الشكل 1B).
ملاحظة: يمكن أن يشير الجانب الغائم أو المبهم من الأنبوب بعد الطرد المركزي إلى تنشيط الخلايا (العدلات) وقد لا تكون مناسبة للاستخدام. - إزالة PBMCs أولا عن طريق الناشئة ماصة الشفط مباشرة في طبقة PBMC. تأكد من أن يستنشق تماما في حين أن طبقة المصل / البلازما يقلل كما تتم إزالة الحلقة. كشط جانب الأنبوب حيث الخلايا بيليه مع ماصة الشفط لتحقيق أقصى قدر من إزالة PMBC. إزالة بعناية الطبقة المتوسطة التدرج كثافة غائم بين حلقة PBMC والكريهة العدلات / RBC.
ملاحظة: كشط الخلايا الكريات على جانب الأنبوب يزيد من نقاء العزلة إلى حد كبير. يجب الحرص على عدم يستنشق بيليه، كما يجلس معظم العدلات مباشرة على رأس RBCs.
2. ترسيب الكريات الحمراء (RBCs)
- باستخدام ماصة 10 مل، نقل بيليه العدلات / RBC في أنبوب نظيف. لا ماصة صعودا وهبوطا. أضف 5٪ FBS/HBSS إلى حجم نهائي يبلغ 25 مل. مزيج بلطف عن طريق عكس.
ملاحظة: تنفيذ الترسيب RBC بعد إزالة PBMC يحسن العائد ويقلل من التنشيط10. - إضافة مباشرة 25 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) 3٪ Dextran/0.9٪ NaCl/ H2O في الأنبوب الذي يحتوي على بيليه العدلات المخففة / RBC ومزيج بلطف عن طريق الانعكاس. ضع الأنبوب على سطح غير مهتز لمدة 15 دقيقة (الشكل 1C).
ملاحظة: الترسيب الأطول يقلل من تلوث RBC ولكنه يقلل أيضا من الغلة. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي التعرض الدكستران لفترات طويلة إلى تنشيط العدلات أو موت الخلية11. - جلب بلطف أنبوب العودة إلى غطاء محرك السيارة (لعزل عقيمة). فقط عن طريق غمر قليلا ماصة في السائل، وجمع الطبقة العليا (~ 30 مل) بعد السطح السائل إلى أسفل.
ملاحظة: إذا كان الترسيب ينتج واجهة حادة بين الوسط و RBCs، بيليه RBC أصغر، أو إذا كان المطلوب غلة أعلى، وجمع ما يصل إلى 35 مل. - تدور الأنبوب (400 × غرام، 10 دقيقة ، RT ، باستخدام الفرامل المنخفضة (3)) ، مما أدى إلى بيليه حمراء مع عدم وجود جزيئات عائمة في وسائل الإعلام.
3. تحلل من RBCs المتبقية
- يستنشق بلطف supernatant دون تعطيل بيليه.
- إضافة 25 مل من المياه فائقة النحافة العقيمة مباشرة في الأنبوب وتخلط بلطف عن طريق عكس لمدة 28 ق لايس RBCs. لا تستخدم ماصة لإعادة إنفاق بيليه.
ملاحظة: لا تتجاوز 30 ق كما يمكن تنشيط ظروف hypotonic لفترات طويلة وتؤدي إلى الموت العدلات12. - إضافة فورا 25 مل من العقيمة 1.8٪ NaCl / H2O في الأنبوب وتخلط بلطف عن طريق عكس لجلب الحل مرة أخرى إلى الظروف متساوي التوتر.
ملاحظة: يجب أن يكون الحل أحمر ولكن بدون عكر. - تدور أسفل في 200 × غرام لمدة 3-5 دقيقة مع انخفاض الفرامل (مستوى 3) لتقليل RBCs والصفائح الدموية الترسيب جنبا إلى جنب مع العدلات (الشكل 1D والشكل 2)13،14.
ملاحظة: يجب أن تكون بيليه بيضاء مع طبقة RBC الحد الأدنى على القمة، والتي يمكن إزالتها بلطف في حين يستنشق supernatant. - Resuspend العدلات عن طريق pipetting الثقافة المتوسطة (10 ٪ FBS/RPMI1640) مباشرة على بيليه ، ولكن لا ماصة صعودا وهبوطا. هز الأنبوب أفقيا من جانب إلى آخر لتقليل تنشيط الخلية.
ملاحظة: يجب أن تبقى الخلايا بتركيز ~2 × 106 خلايا/مل، حيث ستؤدي الكثافة العالية إلى زيادة تنشيط/موت الخلية15. لنفس السبب، يجب إعادة إنفاق بيليه الخلية في أقرب وقت ممكن. - إذا لوحظ تجميع الخلايا أو تكتلها، قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام شبكة 70 ميكرومترا لتجاهل العدلات المتجمعة.
4. تحديد جودة عزل العدلات
- وصمة عار الخلايا مع علامات محددة ل العدلات (CD66b، CD11b)، اليوزينية (CD193) (الشكل 3)،وعلامة التنشيط مثل CD62L (الشكل 4). الحصول على 20،000 الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. تحليل نقاء الخلية والتنشيط باستخدام استراتيجيات gating المقترحة في الشكل 3 والشكل 4.
ملاحظة: يمكن تقييم جودة إعداد العدلات باستخدام محلول أزرق 3٪ من حمض الخليك الميثيلين لتصور نواة الفصوص الفريدة من العدلات. - تحديد صلاحية الخلية باستخدام الملحق الخامس / البروبيديوم يوديد (PI) (الشكل 5).
ملاحظة: يمكن استخدام تلطيخ الأزرق تريبان لتقييم صلاحية الخلية.
Representative Results
عند استخدام تدرج الكثافة لتنقية العدلات، من المهم أن تكون الواجهة بين الدم ومتوسط تدرج الكثافة حادة قدر الإمكان، وأن يبقى فصل طبقة متميزة بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.4). بعد تحلل RBC، يجب أن يكون المخزن المؤقت أحمر واضح وليس متعكر (الخطوة 3.3). إذا كان التحضير غائما، فقد تكون هناك حاجة إلى جولة ثانية من التحلل (الخطوة 3)، على الرغم من أن هذا قد يؤثر على بقاء العدلات(الشكل 1). بعد التحلل، يوصى بالطرد المركزي منخفض السرعة (200 × غرام)عند إعطاء الأولوية للنقاء، لأنه يقلل من تلوث الصفائح الدموية بشكل كبير. ومع ذلك، فإن الطرد المركزي عالي السرعة (400 × غرام)يزيد من العائد على حساب النقاء (الخطوة 3.4، الشكل 2). بعد عزل العدلات، يمكن استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورسين لتقييم نقاء العزل (الخطوة 4.1) وينبغي اختياره على المجهر. على الرغم من أن توزيع FSC / SSC للخلايا وحدها يوفر تقديرا لنوعية عزل الخلية(الشكل 3A)، ينبغي تفضيل استخدام علامات خلايا محددة. في هذه الحالة، تلطخ مجموعات الخلايا الملوثة الأكثر شيوعا بأجسام مضادة محددة مع CD66b، ويتم التعبير عنها خصيصا على الخلايا الحبيبية. يستخدم تلطيخ CD45 للتمييز بين الكريات البيض (CD45+) وخلايا الدم الحمراء والصفائح الدموية (CD45-).
وتشمل الملوثات الأخرى الخلايا الليمفاوية (CD3 + أو CD19 + ، الشكل 3F)، monocytes (CD14 + ، الشكل 3D)، واليوزينيات (CD193 + ، الشكل 3G). CD11b هو integrin التعبير عن النسب النخاعي; العدلات والخلايا الأحادية هي CD11b +، في حين أن الخلايا الليمفاوية هي CD11b- (الشكل 3C). وبما أن تنشيط العدلات يمكن أن يؤثر على تجارب المصب، ينبغي تقييم التعبير عن CD62L؛ العدلات تصبح CD62L- تنشيط مرة واحدة (الخطوة 4.1). الببتيد fMLP يمكن استخدامها كتحكم إيجابي للCD62L سفك (الشكل 4). من المهم أيضا تقييم صحة العدلات قبل إجراء عمليات الفحص؛ العدلات لها نصف عمر قصير نسبيا، والتنشيط يمكن أن تقصر أكثر من ذلك (الخطوة 4.2). يمكن أن يعطي تلطيخ الملحق الخامس وPI القياسي معلومات عن الحالة الحية / الميتة لثقافة العدلات في أوقات معينة(الشكل 5).
الشكل 1: الكثافة الانحدار متوسطة أساس فصل الحبيبات. (أ) قبل و (ب) بعد الطرد المركزي. لاحظ الواجهة الحادة بين الدم والطبقات المتوسطة المتدرجة للكثافة. (ج) ترسيب بيليه في B إعادة الإنفاق (1:1) في 5٪ FBS/ HBSS و 3٪ Dextran-0.9٪ NaCl. (D) بيليه PMN بعد تحلل من RBCs المتبقية في supernatant من (C) مع H2O. اختصارات: PBMC = خلايا الدم المحيطي أحادية النووية; PMN = العدلات; RBC = خلايا الدم الحمراء; FBS = مصل الأبقار الجنينية; HBSS = حل الملح المتوازن هانك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:الغزل بسرعات أقل بعد انخفاض تحلل RBC تلوث الصفائح الدموية. بعد تحلل RBCs مع H2O، نسج الخلايا أسفل في 200 × ز (أ) أو 400 × ز (B). كانت ملطخة العدلات، وتم إجراء تحليل تدفق قياس الخلايا، كما هو موضح في الشكل 3،مع إضافة المضادة CD41 لتسمية الصفائح الدموية. المختصرات: RBC = خلايا الدم الحمراء. CD41 = مجموعة من التمايز 41؛ SSC-A = الجانب مبعثر المنطقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تقييم العدلات معزولة عن معطف بافي. كانت العدلات المعزولة ملطخة بمضادات CD66b ومكافحة CD11b ومكافحة CD14 ومكافحة CD193 باتباع بروتوكول قياسي. تم بوابة الخلايا المفردة(B)من إجمالي الخلايا (A). (C) تم بوابات CD11b+ الخلايا من خلايا واحدة. (D) نقطة مؤامرة تظهر العدلات (CD66b+، CD14 منخفضة / -) وتلوث أحادية منخفضة جدا (CD66b-، CD14+، Q1). (E) CD66b- وCD66b+ تم بوابات الخلايا. (F) CD66b- كانت الخلايا إيجابية لعلامات الخلايا الليمفاوية (CD3، CD19). (G) التعبير عن CD11b و CD193 في CD66b+ الخلايا، والتي تبين العدلات متميزة (CD66b+، CD11b+، CD193-) وeosinophil (CD66b+، CD11b-، CD193+) السكان. في النتيجة التمثيلية المبينة هنا ، يكون نقاء العدلات ~ 93٪ مع ~ 3.7٪ من الخلايا الليمفاوية و ~ 3.7٪ تلوث اليوزينيات. (ح)تحديد كمية نقاء العدلات بعد تنقية. يتم تجميع البيانات من 5 تجارب فردية وتقدم على أنها متوسط ± SD. المختصرات: CD = مجموعة من التمايز؛ SSC-A = SSC-A = ناحية مبعثرة جانبية؛ FSC-A = إلى الأمام مبعثر المنطقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تنقية التدرج لم يسبب CD62L سفك. (أ-ب) التحكم (أ) أو العدلات fMLP حفز (ب) (1 mM fMLP لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية) كانت ملطخة بعلامات العدلات وCD62L. (C) يتم تقليل كثافة متوسط الفلورسنت لCD62L في الخلايا المعالجة fMLP، مما يشير إلى سفك CD62L وتفعيل العدلات. الاختصارات: CD26L = L-selectin; fMLP = N-فورميلميثيل-ليوسيل-فينيل ألانين; SSC-A = SSC-A = ناحية مبعثرة جانبية؛ FSC-A = إلى الأمام مبعثر المنطقة; PE = فيكوريثرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:الموت التلقائي للنيوتروفيليا التي يتم تنقيتها بواسطة تدرج الكثافة أو طقم العزل العدلي. تم تنقية العدلات مع تدرج الكثافة(A و B)أو الميكروبات التجارية(C و D)ومثقفة لمدة 0 ساعة(A و C)أو 24 ساعة(B و D) في RPMI-10٪ FCS. وكانت الخلايا ملطخة باستخدام الملحق الخامس وPI في النقاط الزمنية ذات الصلة بعد بروتوكول قياسي. (ه)تحديد كمي من تنقية العدلات الموت العفوي. n = 5، يعني ± SD. اختصارات: SSC-A = SSC-A = الجانب مبعثر المنطقة؛ FSC-A = إلى الأمام مبعثر المنطقة; PI = يوديد البروبيديوم; FCS = مصل العجل الجنيني; FITC = ايزوثيوسيانات الفلورسين; AV5 = Annexin V. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
نظرا لمدى الحياة القصير ، وحالة التمايز النهائي ، والمحتوى الليتيكي للنيوتروفيليا ، فإن دراسة هذه الخلايا كانت دائما تحديا. وبصرف النظر عن استخدام نماذج الماوس أو الخلايا من أفواج المرضى، وخطوط الخلايا هي أدوات مفيدة للمساعدة في دراسة بيولوجيا العدلات16. ومع ذلك، لا يمكن لخطوط الخلايا الشبيهة بالنيوتروف أن تكرر تماما جميع جوانب بيولوجيا العدلات، مما يضيف طبقة إضافية من الصعوبة في دراسة هذه الخلايا. النموذج الأكثر استخداما في المختبر هو خط الخلية HL-60، والتي يمكن تمييزها إلى خلايا تشبه العدلات عن طريق العلاج مع ثنائي ميثيل سلفكسيد أو حمض الريتينويك17،18. على الرغم من أن هذه الخلايا مفيدة في دراسة الهجرة وانفجار الجهاز التنفسي، فهي ليست مناسبة لدراسة النشاط الميكروبيوسيدال من العدلات. توجد خطوط الخلايا الأخرى (PLB-98, NB4) ، وهي أيضا مقترنة بمجموعة القيود الخاصة بهم19.
ومن المحوري للتحقق من صحة مع الملاحظات العدلات البشرية الأولية التي أدلى بها مع نماذج مرض الماوس وخطوط الخلايا. لا يمكن تقديم العدلات بشكل فعال وبالتالي غالبا ما تكون معزولة حديثا عن الدم الكامل أو المعاطف البرتقالية التي يتم الحصول عليها من المتبرعين ومعالجتها على الفور. مرة واحدة معزولة, الخلايا تبدأ في الخضوع لشكل معقد من الموت العفوي, ينظمها الأكسدة, caspases السيتوبلازمية, وبروتياز وجدت في حبيبات العدلات20,21. يمكن أن تؤدي طرق العزل غير السليمة أو التقنيات إلى تنشيط العدلات ، مما يؤدي فقط إلى تسريع زوال الخلايا. من الضروري أن يكون لدينا طريقة موثوقة ومتسقة للحصول على العدلات النقية وعالية الجودة من المتبرعين.
كانت هناك العديد من الطرق المنشورة على عزل العدلاتالبشرية 10،22. وهي تندرج أساسا في فئتين، مع بعض الاستراتيجيات المشتركة. الفئة الأولى هي الأجسام المضادة القائمة، ويجري إما من خلال الاختيار الإيجابي أو السلبي. اختيار إيجابي من شأنه أن تسمية العدلات مباشرة، وبالتالي توفير مجموعة خلايا نقية للغاية، على الرغم من أنه يؤدي أيضا إلى تنشيط الخلية السريع، موت الخلية، فضلا عن وضع علامات غير المرغوب فيها من العدلات23. الاختيار السلبي، على الرغم من ترك الخلايا دون تسمية وإعطاء السكان نقية جدا، والموت العدلات المتسارع، على الرغم من أن الآلية الدقيقة غير معروف(الشكل 5). ما إذا كان يتم تغيير التعبير الجيني أو البروتين أيضا بعد اختيار إيجابي أو سلبي يحتاج إلى مزيد من التحقيق. وعلاوة على ذلك، نظرا لكمية الأجسام المضادة اللازمة لاستنفاد أنواع أخرى من الخلايا، وهذه الأساليب لا يمكن إخراج كميات كبيرة من العدلات. ومع ذلك، لا يزال من الممكن استخدام المقايسات القائمة على الأجسام المضادة للثقافة والتجارب على المدى القصير على نطاق أصغر، وهي طرق اختيار للتجارب التي تتطلب نقاء خلايا عالية جدا، مثل دراسات التعبير عن الجينات والبروتين.
النوع الثاني من أسلوب العزل هو التدرج والكثافة المستندة. وعادة ما ينطوي على Percoll، Ficoll-Paque، أو غيرها من مكونات البوليساكريد / polyvinylpyrrolidone ويستخدم قوة الطرد المركزي لفصل أنواع مختلفة من خلايا الدم على أساس كثافة الخلية. وغالبا ما تستكمل هذه الأساليب مع ترسب خلايا الدم الحمراء عن طريق الدكستران. هذه الأساليب يمكن التعامل مع جداول أكبر من المواد بدءا ويمكن تحقيق نقاء عالية كذلك. تحذير واحد من العزلة القائمة على الكثافة هو الفصل غير الفعال للخلايا الحبيبية الأخرى الأقل وفرة (معظمها من الحمضات) من العدلات ، وبالتالي ، فإن القيد الرئيسي للبروتوكول المقدم ، حتى وجود تلوث الخلايا الصغيرة يمكن أن يؤثر على استجابة العدلات24.
هنا هو أسلوب موجز على أساس العزلة التدرج ، وصقل الأساليب السابقة10،22. نحن نستخدم التقليل الحالي من خصوصيات العدلات لعزل العدلات البشرية النقية بشكل موثوق مع الصفائح الدموية المتبقية المحدودة وRBCs ، ومنع تنشيط العدلات والموت المتسارع. الخطوة الأكثر أهمية هي طبقات التدرج ، والتي يتم الحصول عليها بشكل أكثر فعالية عن طريق إضافة متوسط تدرج الكثافة تحت الدم للحصول على واجهة حادة. يمكن أن يكشف الفحص السريع لحلقة PBMC والتدرج بعد الطرد المركزي عن التلوث المحتمل والتنشيط وانخفاض الغلة. عند العمل مع غشاء leukapheresis أو معطف برتقالي ، فإن تمييع الدم مهم لأن كثافة الخلايا المفرطة ستؤدي إلى تجميع الخلايا ، مما يؤدي إلى الشوائب وتنشيط الخلية.
يجب إكمال هذا البروتوكول في غضون 2 ساعة لضمان نضارة الخلية ، ويتم الخطوات التي تنطوي على متوسط تدرج الكثافة ، وdxtran ، والتحلل على الفور ، حيث يمكن أن يغير التعرض لهذه الحلول العدلات. مع هذا البروتوكول، والغلة المتوقعة من العدلات هو ما لا يقل عن ~ 10 مليون/10 مل من الدم كله وعلى الأقل ~ 60 مليون/10 مل من معطف بافي. يجب إجراء تقييم جودة العزل على النحو التالي: يجب أن تكون العدلات المنشطة أقل من 10٪، وتلوث الخلايا الليمفاوية أقل من 5٪، والحد الأدنى من الحمضات (نفس الجانب مبعثر ولكن أقل إلى الأمام مبعثر السكان)، وينبغي أن تكون صلاحية الخلية أكثر من 90٪. يمكن أن ينتج انخفاض النقاء عن طبقات غير سليمة أو تخزين متوسط تدرج الكثافة أو بسبب جودة ونضارة منتج الدم الأولي.
Disclosures
ويعلن المؤلفان أن البحث أجري في غياب أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا المشروع من قبل P01HL095489. A.Y.H كان مدعوما من قبل T32HL066987.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
| Attune NxT | invitrogen | A24858 | FACS analyzer |
| Cd11b-PE | biolegend | 301305 | |
| CD14-BV421 | biolegend | 367144 | |
| CD193-BV605 | biolegend | 310716 | |
| CD19-PerCP | biolegend | 302228 | |
| CD3-PerCP | biolegend | 300326 | |
| CD41-APC | biolegend | 303710 | |
| Cd45-APC | biolegend | 103111 | |
| CD62L-PE | biolegend | 304802 | |
| CD66b-FITC | biolegend | 305103 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | Centrifuge |
| Dextran | Fisher | BP1580 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11150H | complement inactivation of FBS is recommended |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD | 556547 | |
| Hanks balanced salt solution (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4) | Gibco | 14175-095 | HBSS without Ca2+/Mg2+ is advised as they have been shown to lead to neutrohpil activation |
| Lymphoprep | Stemcell technologies | #07801 | density gradient medium |
| MACSxpress Whole Blood Neutrophil Isolation Kit, human | Miltenyi | 130-104-434 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | |
| Sodium chloride | sigma | 71376 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| ultrapure water | KD medical | RGF-3410 |
References
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Stoller, J. K. Murray & Nadel's textbook of respiratory medicine, 6th edition. Annals of the American Thoracic Society. 12 (8), 1257-1258 (2015).
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A.
- Manz, M. G., Boettcher, S.
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Tucker, K. A., Lilly, M. B., Heck, L., Rado, T. A. Characterization of a new human-diploid myeloid-leukemia cell-line (Plb-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood. 70 (2), 372-378 (1987).
- Hsu, A. Y., et al. Inducible overexpression of zebrafish microRNA-722 suppresses chemotaxis of human neutrophil like cells. Molecular Immunology. 112, 206-214 (2019).
- Kremserova, S., Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 2087, 33-42 (2020).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunological Research. 2017, 1254792 (2017).
- Thorson, L. M., Turkalj, A., Hung, J. C. In vitro evaluation of neutrophil viability after exposure to a hypotonic medium. Nuclear Medicine Communications. 16 (7), 615-620 (1995).
- Dhurat, R., Sukesh, M. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: a review and author's perspective. Journal of Cutaneous and Aesthetetic Surgery. 7 (4), 189-197 (2014).
- Etulain, J., et al. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Scientific Reports. 8 (1), 1513 (2018).
- Hannah, S., et al. Constitutive neutrophil apoptosis in culture is modulated by cell density independently of beta2 integrin-mediated adhesion. FEBS Letters. 421 (2), 141-146 (1998).
- Hsu, A. Y., et al. Phenotypical microRNA screen reveals a noncanonical role of CDK2 in regulating neutrophil migration. Proceedings of the National Acadermy of Sciences of the United States of America. 116 (37), 18561-18570 (2019).
- Martin, S. J., Bradley, J. G., Cotter, T. G. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clinical and Experimental Immunology. 79 (3), 448-453 (1990).
- Hauert, A. B., Martinelli, S., Marone, C., Niggli, V. Differentiated HL-60 cells are a valid model system for the analysis of human neutrophil migration and chemotaxis. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 34 (7), 838-854 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Siemsen, D. W., et al. Neutrophil isolation from nonhuman species. Methods in Molecular Biology. 1124, 19-37 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), 17314 (2011).
- Calzetti, F., Tamassia, N., Arruda-Silva, F., Gasperini, S., Cassatella, M. A. The importance of being "pure" neutrophils. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (1), 352-355 (2017).
